Etude du rôle de la protéine S et du potentiel thérapeutique d'un anticorps à domaine unique potentialisant son activité dans la drépanocytose

Exploring the role of the protein S and the therapeutic potential of a single-domain antibody that enhances its activity in sickle cell disease.

• Auteur / Autrice : Claire Auditeau
• Direction : Delphine Borgel, François Saller
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences pharmacologiques
• Date : Soutenance en 2025
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Hémostase, Inflammation, Thrombose
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté de pharmacie
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Santé et médicament (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Corinne Frere
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Anne Angelillo-scherrer, Loïc Garcon, Slimane Allali
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Angelillo-scherrer, Loïc Garcon

Mots clés

Mots clés libres

Protéine S

Protéine C activée

Drépanocytose

Anticorps à domaine unique

Crise vaso-occlusive

Protein S

Activated C protein

Sickle cell disease

Single domain antibody

Vaso occlusive crisis

Résumé

La protéine S (ProS) est une protéine anticoagulante physiologique, connue notamment pour son rôle de cofacteur de la protéine C activée (PCa). La ProS est également impliquée dans l'efférocytose, i.e. la clairance physiologique des cellules apoptotiques exposant la phosphatidylsérine (PtdSer), via l'activation du récepteur MerTK sur les macrophages. La drépanocytose est une anémie hémolytique congénitale caractérisée par la présence d'une hémoglobine anormale dans les globules rouges (GR), l'hémoglobine S (HbS). L'HbS polymérise lorsqu'elle est désoxygénée, entrainant une déformation des GR, une hémolyse et des phénomènes de vaso-occlusion des microvaisseaux. Dans cette pathologie, une exposition anormale de la PtdSer a été retrouvée à la surface des GR, et en particulier de particules issues de leur hémolyse, appelées eryghosts. Cette population de GR étant encore très peu étudiée, nous avons cherché à étudier leur importance physiopathologique dans la drépanocytose ainsi que la capacité de la ProS à faciliter leur phagocytose par des macrophages. Dans un tout premier temps, nous avons mis au point un modèle de phagocytose in vitro par des macrophages dérivés de monocytes THP-1. Dans ce modèle, la ProS augmentait par un mécanisme dépendant de MerTK la phagocytose de GR traités à l'ionomycine et les eryghosts générés par une hémolyse in vitro. Ces deux populations exposent fortement la PtdSer, contrairement aux GR normaux, dont la phagocytose n'était pas influencée par la ProS. Parallèlement, la phagocytose d'eryghosts isolés chez des patients drépanocytaires et exposant de la PtdSer était potentialisée par la ProS via MerTK, contrairement à celle des GR intacts de ces patients, qui ne l'exposaient pas. L'observation de coupes de rates en microscopie électronique à transmission a révélé pour la première fois la présence d'eryghosts, y compris dans les macrophages, dans la rate de patients drépanocytaires. Contrairement à ce qui est observé dans le sang périphérique, la proportion d'eryghosts dans les rates des patients sans pathologie du GR était plus élevée que celle des rates de patients drépanocytaires. Le taux circulant d'eryghosts était corrélé à l'intensité de l'hyposplénisme des patients drépanocytaires, suggérant que leur élimination est défaillante dans cette pathologie. De plus, la pathogénicité des eryghosts liée à l'activation de la coagulation et l'adhérence aux cellules endothéliales a été démontrée in vitro au cours de cette thèse. L'efférocytose des eryghosts médiée par la ProS pourrait donc être un mécanisme protecteur, mais altéré chez les patients drépanocytaires. De plus, ce processus d'efférocytose pourrait participer à la diminution des taux plasmatiques de ProS, qui est fréquemment observée chez les patients drépanocytaires. PS003biv, un anticorps à domaine unique de lama dirigé contre la ProS, potentialise paradoxalement son activité cofacteur de la PCa, qui est fréquemment diminuée chez les patients drépanocytaires. Un test de coagulation plasmatique réalisé sur le plasma de patients sélectionnés pour avoir une diminution de cette activité, a démontré la normalisation de celle-ci en présence de PS003biv. De plus, PS003biv a significativement potentialisé l'efférocytose médiée par la ProS des eryghosts isolés du plasma de patients drépanocytaires dans notre modèle in vitro de phagocytose. Enfin, dans deux modèles in vivo de crise vaso-occlusive provoquée chez des souris drépanocytaires, l'injection de PS003biv diminuait la congestion vasculaire dans les poumons et le foie, ainsi que les marqueurs d'hémolyse. En conclusion, les travaux réalisés au cours de cette thèse contribuent à une meilleure compréhension du rôle de la ProS dans la physiopathologie de la drépanocytose, et ouvrent la voie à une nouvelle stratégie thérapeutique reposant sur la potentialisation de ses activités biologiques.

Protein S (ProS) is an anticoagulant protein, primarily known for its role as a cofactor for activated protein C (APC). ProS is also involved in efferocytosis, the physiological clearance of apoptotic cells exposing phosphatidylserine (PtdSer), through the activation of the MerTK receptor on macrophages. Sickle cell disease (SCD) is an inherited hemolytic anemia characterized by an abnormal hemoglobin (HbS). HbS polymerizes when deoxygenated, causing red blood cells (RBC) sickling, hemolysis, and microvascular vaso-occlusion. In this disease, abnormal PtdSer exposure has been observed on the surface of RBC, particularly on particles resulting from their hemolysis, called eryghosts. Only scarce information is available on eryghosts, therefore we aimed to explore their pathophysiological importance in SCD and the ability of ProS to enhance their phagocytosis by macrophages. We first developed an in vitro phagocytosis model using THP-1 monocyte-derived macrophages. In this model, ProS enhanced the phagocytosis of ionomycin-treated RBC and eryghosts resulting from in vitro hemolysis through a MerTK-dependent mechanism. Both populations strongly exposed PtdSer, unlike normal RBC, whose phagocytosis was not influenced by ProS. Additionally, the phagocytosis of PtdSer-exposing eryghosts isolated from SCD patients was promoted by ProS via MerTK, while intact RBC from these patients that did not exposed PtdSer, were spared. Transmission electron microscopy images of spleen sections revealed, for the first time, the presence of eryghosts, including within macrophages, in the spleen of SCD patients. Unlike in peripheral blood, the proportion of eryghosts in the spleens of individuals without RBC disorders was higher than in those of SCD patients. The circulating level of eryghosts correlated with hyporsplenism severity in SCD patients, suggesting defective clearance in this pathology. Furthermore, the pathogenicity of eryghosts related to coagulation activation and endothelial cell adhesion was demonstrated in vitro. ProS-mediated efferocytosis of eryghosts could thus act as a protective mechanism, but it is altered in SCD patients. Moreover, this efferocytosis process may contribute to the decreased plasma levels of ProS, which are commonly observed in SCD patients. PS003biv, a single-domain llama antibody targeting ProS, paradoxically potentiates its APC-cofactor activity, which is often reduced in SCD patients. A coagulation assay performed on the plasma from patients with decreased APC-cofactor activity, and showed a normalization of this activity in the presence of PS003biv. Additionally, PS003biv significantly enhanced ProS-mediated efferocytosis of eryghosts isolated from SCD patient plasma in our in vitro phagocytosis model. Finally, in two in vivo models of vaso-occlusive crisis in sickle mice, PS003biv injection reduced vascular congestion in the lungs and liver, as well as plasma biomarkers of hemolysis. In conclusion, this work contributes to a better understanding of the role of ProS in the pathophysiology of SCD and paves the way for a new therapeutic strategy based on potentiating its biological activities.