Conception d'un système modulaire pour la délivrance intracellulaire de fragments d'anticorps par l’utilisation du domaine de translocation de la toxine diphtérique

Design of a modular system for intracellular delivery of antibody fragments using diphtheria toxin’s translocation domain

• Auteur / Autrice : Anaïs Djebara
• Direction : Pierre Martineau, Laurence Guglielmi
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 12/12/2024
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IRCM - Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Criblage fonctionnel et criblage du cancer.
• Jury : Président / Présidente : Pascale CRéPIEUX
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre Martineau, Laurence Guglielmi, Stéphanie Cabantous
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pascale CRéPIEUX, Stéphanie Cabantous

Mots clés

Mots clés libres

Ingénierie des protéines

Fragment d'anticorps

Toxine diphtérique

Délivrance intracellulaire

Intracorps

Protein engineering

Antibody fragment

Diphtheria toxin

Intracellular delivery

Intrabody

Résumé

Les fragments d’anticorps tels que les scFv présentent un potentiel thérapeutique intéressant pour cibler des protéines intracellulaires du fait de leur spécificité et de leur capacité à cibler les interactions protéine-protéine. La mise au point d’une approche permettant leur transport spécifiquement dans le cytosol des cellules cancéreuses représente encore un enjeu de taille pour leur utilisation en thérapie. Ce projet visait à étendre l’utilisation des fragments d’anticorps à des cibles intracellulaires en développant un système permettant de les transporter spécifiquement dans le cytosol des cellules cancéreuses à des fins thérapeutiques. Les exotoxines bactériennes, telles que la toxine diphtérique (TD), représentent un modèle d'internalisation naturels capables de transporter des domaines cytotoxiques dans le cytoplasme. La TD se compose de trois domaines fonctionnels : (1) le domaine cytotoxique N-terminal (C), (2) le domaine de translocation (T) et (3) le domaine de liaison au récepteur C-terminal (R). Dans les cellules mammifères, la liaison du domaine R au récepteur HB-EGF engendre l’internalisation de la TD dans les endosomes. Le domaine T forme ensuite un pore dans la membrane endosomale, permettant au domaine C d'en sortir et d’atteindre sa cible cytoplasmique, le facteur eEF-2. L'objectif de ce projet de thèse était d’utiliser le mécanisme naturel de la TD pour internaliser des fragments d'anticorps actifs dans le cytoplasme. Pour cibler un type cellulaire spécifique, nous avons remplacé le domaine R par un scFv dérivé de l’anticorps trastuzumab, utilisé en clinque pour le traitement des cancers surexprimant HER2, notamment les cancers du sein et de l'ovaire (formes intermédiaires). Après avoir mis au point les conditions de production et de purification de ces protéines de fusion complexes, nous avons confirmé par ELISA que les formes intermédiaires se lient spécifiquement à la protéine recombinante HER2. Nous avons ensuite démontré que les fusions se lient aux lignées cellulaires exprimant HER2 et sont internalisées par ces cellules. Par la suite, afin de cibler une protéine intracellulaire, le domaine C a été remplacé par le scFv 2G4 (forme cpAb), un anti-α-tubuline, nous avons ainsi généré les formes finales de fusions. Des tests de complémentation Split-GFP et les essais de biotinylation BirA-Avi-tag ont été utilisés comme outils de détection intracellulaire. Ces derniers visaient à évaluer l'internalisation du 2G4 et sa fonctionnalité dans le cytoplasme après internalisation. Ce système innovant pourrait permettre de faciliter l'internalisation de fragments d'anticorps intracellulaires actuellement développés contre des cibles cytoplasmiques difficiles à cibler, telles que la famille des protéines RAS.

Antibody fragments, such as scFvs, hold significant therapeutic potential for targeting intracellular proteins due to their specificity and ability to interact with protein-protein interfaces. However, the development of a method to specifically deliver these fragments into the cytosol of cancer cells remains a major challenge for their therapeutic application. This project aimed to expand the use of antibody fragments to intracellular targets by developing a system for delivering them specifically into the cytosol of cancer cells for therapeutic purposes. Bacterial exotoxins, such as diphtheria toxin (DT), serve as a natural internalisation model capable of delivering a cytotoxic domain into the cytoplasm. DT consists of three functional domains: (1) the N-terminal cytotoxic domain (C), (2) the translocation domain (T), and (3) the C-terminal receptor-binding domain (R). In mammalian cells, the binding of R-domain to the HB-EGF receptor triggers the internalization of DT into endosomes. The T domain then forms a pore in the endosomal membrane, allowing the C-domain to escape and reach its cytoplasmic target, the eEF-2 factor. The aim of this thesis project was to use DT natural mechanism to internalise intracellularly active antibody fragments. To target a specific cell type, we replaced R-domain with an scFv derived from the trastuzumab antibody, which is clinically used to treat cancers that overexpress HER2, notably breast and ovarian cancers (intermediate fusion forms). After optimising the production and purification conditions for these complex fusion proteins, we confirmed by ELISA that the intermediate forms specifically bind to recombinant HER2 protein. We then demonstrated that the fusions bind to HER2-expressing cell lines and are internalised by these cells. Following this, to target an intracellular protein, the C-domain was replaced by the scFv 2G4 (cpAb form), an anti-α-tubulin antibody, generating the final fusion forms. Split-GFP complementation assays and BirA-Avi-tag biotinylation tests were employed as intracellular detection tools to evaluate the internalisation of 2G4 and its functionality in the cytoplasm after internalisation. This innovative system could facilitate the internalization of intracellular antibody fragments currently being developed against challenging cytoplasmic targets, such as the RAS protein family.