Microbiote intra-tumoral et hétérogénéité de l'adénocarcinome du pancréas

Intra-tumoral microbiota and pancreatic ductal adenocarcinoma hetereogeneity

• Auteur / Autrice : Marc Hilmi
• Direction : Cindy Neuzillet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du Cancer
• Date : Soutenance le 17/10/2024
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie Cellulaire et Cancer
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Christophe Borg
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Cindy Neuzillet, Aurélien de Reyniès, Sophie Vasseur, Rémy Nicolle, Corinne Bousquet, Jérôme Cros, Lisa Derosa
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Aurélien de Reyniès, Sophie Vasseur

Mots clés

Mots clés libres

Cancer du pancreas

Microbiote

Microenvironnement tumoral

Pancreatic cancer

Microbiota

Tumoral microenvironment

Résumé

L'adénocarcinome canalaire du pancréas (ACP) est l’un des cancers dont le pronostic est le plus sombre et son incidence est en augmentation. Les options thérapeutiques restent limitées. L’ACP est caractérisé par un stroma abondant composé essentiellement de matrice extracellulaire, de fibroblastes (CAFs) et de cellules immunitaires. L'hétérogénéité de ce cancer pourrait expliquer en partie l’échec des différentes stratégies thérapeutiques (dont l’immunothérapie) ayant été testées jusqu’à ce jour dans l’ACP. L’ACP présente un environnement unique favorable à la colonisation bactérienne en raison de la vascularisation perméable des vaisseaux tumoraux, de l’immunoexclusion fréquente et de l’hypoxie intra-tumorale contenant des régions nécrotiques riches en nutriments pour les bactéries. De plus, les caractéristiques des cellules tumorales et stromales conditionnent la localisation des bactéries au sein des tumeurs. L’hypothèse est que le microbiote intra-tumoral intervient dans la complexité de l’ACP avec des interactions mutuelles entre bactéries, cellules tumorales et stromales. Plusieurs méthodes d’analyse bactériennes ont été mises au point puis comparées dans des réplicats d’échantillons d’ACP humains. Les kits d’amplifications Qiagen ciblant une région ou plusieurs régions variables du gène de l’ARN ribosomal 16S sont relativement similaires. L’utilisation du kit d’amplification Qiagen a été déployé sur une étude ancillaire de l’essai SHIVA01 en montrant le lien entre la diversité bactérienne, la composante immunitaire et la survie des patients atteints de différents types de cancers, renforçant l’hypothèse d’un axe microbiote-immunité-cancer. Le développement d’un kit personnalisé par capture du gène de l’ARN ribosomal 16S s’est montré non concluant au moins en partie en raison d’une capture trop peu spécifique des bactéries en comparaison aux gènes humains. Un pipeline basé sur le séquençage de l’ARN ribo-déplété utilisant des techniques de filtres et alignements de lectures a été mis au point sur plusieurs types d’échantillons fixés en formaline et inclus en paraffine. L’hétérogénéité des cellules tumorales et stromales a été étudiée avec des techniques d’analyses d’images. Pour les cellules tumorales, un processus en plusieurs étapes a été utilisé pour sélectionner rigoureusement des marqueurs en immunohistochimie capables de différencier les sous-types moléculaires d’ACP et d'évaluer facilement l’hétérogénéité tumorale à l'aide d'une approche basée sur des tuiles de lames empilées digitalement. Ce panel a révélé les limites de la classification binaire basale/classique en mettant en évidence un groupe intermédiaire majeur. Un degré élevé d'hétérogénéité intra- et inter-tumorale a été mis en évidence. La présence d'un composant mineur de type basal était le facteur pronostique le plus important. L’analyse des lésions prénéoplasiques au sein des tumeurs donnait des indications importantes sur le processus d'évolution de la carcinogenèse pancréatique, d'un phénotype classique à un phénotype basal en passant par un phénotype intermédiaire. Pour les CAFs, une technique de multiplex immunofluorescence basée sur cinq de leurs marqueurs (aSMA, FAP, périostine, podoplanine, myosine 11) a permis d’évaluer les différents types de CAFs, leurs interactions et leurs proportions au sein de la tumeur. L’étude multidimensionnelle des bactéries, des cellules tumorales, immunitaires et fibroblastiques au sein des même échantillons d'ACP a finalement été menée pour faire le lien entre ces différentes composantes.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the cancers with the poorest prognosis, and its incidence is increasing. Treatment options remain limited. PDAC is characterized by an abundant stroma composed mainly of extracellular matrix, fibroblasts (CAFs) and immune cells. The heterogeneity of this cancer may partially explain the failure of the various therapeutic strategies (including immunotherapy) evaluated to date in PDAC. PDAC presents a uniquely favorable environment for bacterial colonization due to the permeable vascularity of tumor vessels, frequent immunoexclusion and intratumoral hypoxia containing nutrient-rich necrotic regions for bacteria. Furthermore, the characteristics of tumor and stromal cells condition the localization of bacteria within tumors. The hypothesis is that the intratumoral microbiota plays a part in the complexity of PDAC, with mutual interactions between bacteria, tumor cells and stromal cells. Firstly, several methods for bacterial analysis in replicates of human PCA samples were developed and compared. The Qiagen amplification kits targeting one or more variable regions of the 16S ribosomal RNA gene are relatively similar. Use of the Qiagen amplification kit was deployed in an ancillary study of the SHIVA01 trial, showing the link between bacterial diversity, the immune component and survival in patients with different types of cancer, reinforcing the hypothesis of a microbiota-immunity-cancer axis. The development of a personalized capture kit proved inconclusive, at least in part due to the lack of specific capture of bacteria compared with human genes. A pipeline based on ribo-depleted RNA sequencing using several filter techniques and read alignment was developed on several types of formalin-fixed and paraffin-embedded samples. The heterogeneity of tumor and stromal cells was studied using image analysis techniques. For tumor cells, a multi-step process was used to rigorously select markers in immunohistochemistry capable of differentiating molecular subtypes of PDAC, and to easily assess tumor heterogeneity using a stacked slide tile-based approach. This panel revealed the limitations of the binary basal-like/classical classification by highlighting a major intermediate group. A high degree of intratumoral and intertumoral heterogeneity was revealed. The presence of a minor basal-like component was the most important prognostic factor. Analysis of preneoplastic lesions within the tumors gave important insights into the evolutionary process of pancreatic carcinogenesis, from a classical phenotype through an intermediate phenotype to a basal phenotype. For CAFs, a multiplex immunofluorescence technique based on 5 of their markers (aSMA, FAP, periostin, podoplanin, myosin 11) was used to assess the different types of CAFs, their interactions and their proportions within the tumor. The multidimensional study of bacteria, tumor cells, immune cells and fibroblasts within the same PDAC samples was finally carried out to link these different components.