Pan-thérapie, médiée par CRISPR/Cas13, pour les myopathies centronucléaires en ciblant DYNAMIN 2

Pan-therapy, CRISPR/Cas13-mediated, for Centronuclear myopathies by targeting DYNAMIN 2

• Auteur / Autrice : Andréa Carlier
• Direction : Stéphane Blot
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Inscription en doctorat le 01/11/2021
• Etablissement(s) : Paris 12
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Sciences de la Vie et de la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IMRB - Institut Mondor de Recherche Biomédicale
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Equipe RELAIX - Biologie du système neuromusculaire

Mots clés

Mots clés libres

Myopathie centronucléaire

Dynamine 2

Pan-therapie

CRISPR/Cas13

Centronuclear myopathy

Dynamin 2

Pan-therapy

CRISPR/Cas13

Résumé

Les myopathies centronucléaires (CNM) sont des myopathies congénitales caractérisées par une hypotrophie et une faiblesse musculaire. Elles sont principalement liées à des mutations des gènes MTM1, BIN1 et DNM2. Ces protéines interagissent en réseau dans le muscle et sont impliquées dans la stabilité et le trafic des membranes des fibres musculaires. Il n'existe actuellement aucun traitement pour les CNM. Notre groupe a contribué à la caractérisation d'un modèle unique de chien DNM2R465W/+ spontané porteur de la mutation R465W, la plus fréquente chez les patients DNM2. Cette mutation confère un gain de fonction à la protéine DNM2. Il a été démontré chez la souris que la réduction de la protéine DNM2 par knockdown spécifique des transcrits DNM2 résout le phénotype des CNM liées à BIN1, MTM1 et DNM2. Cette observation ouvre la voie à une pan-thérapie ciblant plusieurs CNM en régulant l'expression d'une seule protéine, DNM2. Le système CRISPR/Cas13 récemment découvert a la capacité, via la protéine Cas13, de dégrader l'ARN cible de manière hautement spécifique. Nous proposons d'utiliser ce système pour réduire les niveaux de transcription du DNM2 dans notre modèle canin comme pan-thérapie pour les CNM. A partir de biopsies musculaires canines, nous avons obtenu des cultures de myoblastes sains et DNM2R465W/+. Une caractérisation de ces myoblastes nous a permis d'identifier des éléments quantifiables pour mesurer l'amélioration phénotypique après traitement. Des transfections cellulaires transitoires du système CRISPR/Cas13 ont montré une réduction significative du transcrit de l'ARNm DNM2 avec une réduction de l'activité GTPase des cellules DNM2R465W/+. La preuve de principe in vivo de cette stratégie a récemment commencé avec des injections intramusculaires de notre système CRISPR/Cas13 via AAV chez des chiens DNM2R465W/+. Des échantillons de muscles seront prélevés un mois et deux mois après l'injection. Afin d'évaluer l'impact de la mutation DNM2R465W/+ sur les cellules souches musculaires, celles-ci ont été quantifiées au cours du temps. Dans le muscle tibial crânien, une réduction de leur nombre a été identifiée à partir de 4 mois par rapport aux chiens sains. Ces quantifications sont en cours dans d'autres muscles différemment affectés par la maladie, et un test de régénération in vivo est envisagé.

Centronuclear myopathies (CNM) are congenital myopathies characterized by hypotrophy and muscle weakness. They are mainly linked to mutations in the MTM1, BIN1 and DNM2 genes. These proteins interact in the muscle as a network, and are involved in the stability and trafficking of muscle fiber membranes. There is currently no treatment for CNMs. Our group has contributed to the characterization of a unique spontaneous DNM2R465W/+ dog model carrying the R465W mutation, the most common in DNM2 patients. This mutation confers a gain-of-function to the DNM2 protein. It has been demonstrated in mice that reduction of DNM2 protein by specific knockdown of DNM2 transcripts resolves the phenotype of CNMs linked to BIN1, MTM1 and DNM2. This observation opens the door to a pan-therapy targeting multiple CNMs by regulating the expression of a single protein, DNM2. The recently discovered CRISPR/Cas13 system has the capacity, via the Cas13 protein, to degrade the target RNA in a highly specific way. We propose to use this system to reduce DNM2 transcript levels in our canine model as a pan-therapy for CNMs. From canine muscle biopsies, we obtained cultures of healthy and DNM2R465W/+ myoblasts. A characterization of these myoblasts allowed us to identify quantifiable elements to measure phenotypic improvement after treatment. Transient cell transfections of the CRISPR/Cas13 system showed a significant reduction in DNM2 mRNA transcript with a reduction in the GTPase activity of DNM2R465W/+ cells. In vivo proof-of-principle of this strategy recently began with intramuscular injections of our CRISPR/Cas13 system via AAV in DNM2R465W/+ dogs. Muscle samples will be taken at one month and two months post-injection. To assess the impact of the DNM2R465W/+ mutation on muscle stem cells, these were quantified over time. In the cranial tibial muscle, a reduction in their number was identified from 4 months onwards compared with healthy dogs. These quantifications are currently being carried out in other muscles differently affected by the disease, and an in vivo regeneration test is envisaged.