Etude du redoxome et des modifications post-traductionnelles associées : application au stress oxydatif du reticulum endoplasmique

par Xhesika Limaj

Projet de thèse en Chimie Analytique

Sous la direction de Giovanni Chiappetta et de Joelle Vinh.

Thèses en préparation à l'Université Paris sciences et lettres , dans le cadre de École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....) , en partenariat avec Laboratoire Plasticité du cerveau (Paris ; 2014-....) (laboratoire) , Spectrométrie de Masse Biologique et Protéomique (equipe de recherche) et de Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la Ville de Paris (établissement opérateur d'inscription) depuis le 01-10-2021 .


  • Résumé

    Lors de leur translocation dans le réticulum endoplasmique (ER), les polypeptides sont glycosylés et repliés sous leur forme native. Pour beaucoup d'entre eux, le repliement est stabilisé par des liaisons disulfure, dans un processus nommé repliement oxydatif des protéines. La formation de ces disulfides est catalysée par l'ER oxidase Ero1, une enzyme FAD qui réduit O2 en H2O2 et qui en retour s'oxyde en disulfide catalytique. Le mauvais repliement des protéines provoque un stress dans l'ER, ce qui déclenche une cascade d'évènements appelée Unfolded Protein Response (UPR) visant à restaurer l'homéostasie des cellules. En effet, si ce stress n'est pas résolu, il peut entrainer la mort cellulaire. Les éléments influençant le devenir des cellules pendant le stress de l'ER ont fait l'objet d'investigations intenses, car elles ont des implications pertinentes pour de nombreuses pathologies humaines, en particulier dans le cadre du cancer et du diabète. Outre la glycosylation, l'oxydation joue un rôle central dans les processus cellulaires. Son propre rôle physiologique et son influence dans les processus liés au cancer ou au vieillissement sont peu compris. Si le stress oxydatif peut perturber les fonctions biologiques, les réactions d'oxydation-réduction (redox) dans une cellule sont souvent très finement régulées. Un nombre croissant de commentaires indiquent que l'oxydation des Cys devrait être considérée comme une modification post traductionnelle impliquée dans la régulation des protéines. Les résidus de méthionine sont également très réactifs et ont été décrits comme impliqués dans les effets croisés de l'oxydation et la glycosylation des protéines. Le statut de la protéine redox a souvent un impact sur son activité catalytique, sa conformation ou les interactions avec les métaux. Le projet est impliqué dans l'étude de l'impact du métabolisme redox sur la pathophysiologie de l'ER. Les bio-analyses disponibles actuellement pour surveiller le stress de l'ER sono basés sur le suivi du titre de certaines protéines clés par immunodétection et par analyse des transcripts associés. Ces techniques sont, par contre, indirectes car elles utilisent des anticorps et d'amorces. La problématique principale en surveillant les proteins impliquées dans la signalisation du stress redox est leur faible abondance. Il est ainsi important d'établir l'identité et les fonctions de deux des composants encore mal caractérisés du métabolisme de l'ER, afin de d'identifier (i) les voies fournissant des équivalents réducteurs des thiols, et (ii) les sources du H2O2 produits pendant le stress, et leur lien fonctionnel avec la voie d'oxydation des thiols et avec l'UPR. Il faut donc concevoir des outils spécifiques pour surveiller les indicateurs du stress de l'ER. L'objectif de ce projet de doctorat est de mettre en place une méthode ciblée de spectrométrie de masse visant à surveiller en une seule analyse de nombreux indicateurs de stress de l'ER comprenant le suivi d'abondance des protéines et des modifications post-translationnelles.

  • Titre traduit

    Study of redoxome and associated posttranslational changes: application tooxidative stress of endoplasmic reticulum


  • Résumé

    When translocated in the endoplasmic reticulum (ER), polypeptides are glycosylated and folded in their native form. For many of them, folding is stabilized by disulfide bonds in a process called oxidative protein folding. The formation of these disulfides is catalyzed by ER oxidase ERO1, a FAD enzyme that reduces O2 to H2O2 and in turn oxidizes into catalytic disulfide. The poor folding of proteins causes stress in the ER, triggering a signaling cascade called Unfolded Protein Response (UPR) to restore cell homeostasis. Indeed, if this stress is not resolved, it can lead to cell apoptosis. The elements influencing the fate of cells during ER stress have been the subject of intense investigations, as they have relevant implications for many human pathologies, particularly in cancer and diabetes. In addition to glycosylation, oxidation plays a role in cellular processes. Its physiological role and influence in the processes related to cancer and aging are little understood. While oxidative stress can disrupt functions, oxidation-reduction (redox) reactions in a cell are often very finely regulated. A growing number of comments indicate that Cysteine oxidation should be considered as a post-translational modification involved in protein regulation. Methionine residues are also highly reactive and have been described as being involved in crosstalk effects of protein oxidation and glycosylation. The redox protein status often has an impact on its catalytical activity, conformation, or interactions with metals. This project is involved in the study of the redox metabolism's impact on ER pathophysiology. The bio-analysis available today to monitor ER stress are based on measuring the levels of certain key proteins by immunodetection assays and analysis of the associated transcripts. These techniques, though, are indirect since they need the use of antibodies and primers. The main issue in monitoring proteins involved in the ER stress signaling is their low abundancy. It is thereby important to establish the identity and functions of two of the still poorly characterized components of the ER metabolism in order to identify (i) the pathways providing reducing equivalents of thiols and (ii) the sources of H2O2 produced during stress and their functional link with the oxidation pathway of thiols and with UPR. Specific tools need to be designed to monitor stress indicators. The aim of the PhD project is to implement a targeted method of mass spectrometry to monitor in a single analysis many indicators of ER stress, including protein abundance tracking and post-translational changes such as cysteine oxidation and serine/threonine phosphorylation.