Exploration de l'ingénierie des vésicules extracellulaires pour permettre l'administration intracellulaire de protéines cargos exogènes

Exploration of extracellular vesicle engineering to enable intracellular delivery of exogenous protein cargos

• Auteur / Autrice : Antonin Marquant
• Direction : Marie Morille, Anne Aubert
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 28/11/2024
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : ICGM - Institut Charles Gerhardt de Montpellier
• Jury : Président / Présidente : Tristan Montier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie Morille, Anne Des rieux, Graça Raposo, Samir El andaloussi, Nicole Meisner-kober, Anne AUBERT-POUëSSEL
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Des rieux, Graça Raposo

Mots clés

Mots clés libres

Vésicules extracellulaires

Bioengineering

Vectorisation de molécules

Protein

Biochimie

Nanotechnologie

Extracellular vesicles

Bioengineering

Drug delivery

Protein

Biochemistry

Nanotechnologies

Résumé

Les Vésicules Extracellulaires (EVs) sont des nanoparticules produites par les cellules et médiateurs clés de la communication intercellulaire. Leur capacité à vectoriser des biomolécules d’une cellule à une autre en font des vecteurs prometteurs pour l’administration intracellulaire de protéines thérapeutiques. Cependant, le chargement des EVs avec des molécules exogènes est complexe et les méthodes actuellement développées présentent des limitations, telles que des problèmes de reproductibilité et aboutissent à de faibles taux de chargement, des caractéristiques peu compatibles avec une application thérapeutique rationnelle. Ainsi, le but de ce travail de doctorat était de développer des méthodes efficaces de chargement de protéines dans les EVs afin de permettre leur délivrance intracellulaire. Nous avons d’abord testé les Protocoles dit Physiques (PP), basés sur des cycles de (dé)congélation ou d’ultrasons par exemple, afin de perméabiliser la membrane des EVs et de permettre la diffusion d’un fragment d’anticorps (scFv) au niveau intraluminal. Nous avons alors obtenu des résultats similaires à la littérature, suggérant un chargement dans les EVs et une vectorisation efficace dans des cellules carcinomateuses ou mésenchymateuses stromales murines (PANC-1 et mMSC) grâce aux PP. Cependant, l’ajout de contrôles et de méthodes de séparation adéquates a permis de démontrer la nature artéfactuelle de ces résultats, causés par des agrégats protéiques généralement non reportés dans la littérature. En conséquence, nous avons changé d’approche et développé une méthode basée sur la conjugaison d’une ancre lipidique (AL) sur la protéine cargo afin de l’insérer dans la membrane des EVs. L’enzyme modèle HRP a été sélectionnée en raison de la sensibilité de détection de son activité biologique. Ainsi, la HRP a été conjuguée avec 2 différents lipides (cholestérol (CLS) et DSPE) en utilisant des polyéthylènes glycol de différente longueur comme connecteurs (1k, 2k et 5k g/mol). Grâce à un panel de méthodes complémentaires, reposant à la fois sur des approches d’analyse de particules globales et individuelles, nous avons pu mettre en évidence l’efficacité de cette approche. En effet, jusqu’à 1000 HRP par EV et 35-50% de la HRP initialement déposée ont été associées aux EVs avec l’ancre CLS, ce qui constitue, à ce jour, un des meilleurs chargements actuellement reportés dans la littérature. De manière intéressante, l’ancrage de la HRP aux EVs a permis une administration intracellulaire particulièrement efficace lorsque des linkers polymériques de faible poids moléculaire ont été utilisés, tandis que l’utilisation de PEG 5k a abouti à une interaction cellulaire limitée, probablement en raison d’un encombrement stérique que nous avons ensuite pu mitiger par un contrôle fin de la densité de cargo à la surface des EVs. Cette étude est, à notre connaissance, la première à caractériser la vectorisation intracellulaire d’une protéine basée sur cette approche. Finalement, la versatilité de cette approche a été démontrée en l’appliquant à un autre type de nanoparticules dérivées de radeaux lipidiques extraits de cellules stromales placentaires mésenchymateuses humaines. Ce travail devrait ouvrir la voie à l’application de cette stratégie pour associer un fragment d’anticorps dirigé contre l’oncoprotéine RAS aux EVs afin de le vectoriser dans des cellules tumorales.

Extracellular Vesicles (EVs) are nanoparticles produced by cells and are key mediators of intercellular communication. Their ability to vectorize biomolecules from one cell to another makes EVs promising vectors for therapeutic protein delivery. However, loading of EVs with exogenous molecules is complex and the current methods developed expose limitations, such as reproducibility issues and low loading rates, features poorly compatible with therapeutic applications. In this context, the aim of this PhD was to develop effective EV-loading approaches for protein cargos in order to enable their functional cell delivery. We initially used Physical Protocols (PP) such as freeze/thaw or ultrasonication to permeabilize EV membrane and enable the diffusion of a fluorescent Single-Chain Variable Fragment of antibody (scFv) inside EVs. We obtained results similar to the literature suggesting successful EV-loading and cell vectorization (in murine mesenchymal stem cells or pancreatic carcinoma PANC-1 cells) using PP. However, after additional controls and development of adequate separation methods, we showed that these observations were actually artifacts due to protein aggregation. We therefore changed our approach and used a strategy based on a lipid anchor (LA) to insert the protein of interest into EV membrane. Horse Radish Peroxidase (HRP) was used as model enzyme for its very sensitive readout, enabling protein activity evaluation and characterization of loading metrics. HRP was conjugated with different LA based on two lipids (cholesterol (CLS) and DSPE) and different polyethylene glycol (PEG) molecular weights (1k, 2k and 5k g/mol). Using a range of complementary methods, based on both bulk and single particle analysis approaches, we were able to demonstrate the effectiveness of this approach. Thus, up to 1000 HRP per EV and 35-50% of initial HRP was associated to EVs using CLS lipid, which is among best EV loading capacity and efficiency obtained until now. Interestingly, effective cell delivery was obtained with low molecular weight PEG while PEG 5k limited cell internalization by steric hindrance. To our knowledge, this is the first study characterizing the intracellular vectorization of a protein using EVs based on this approach. Finally, we demonstrated the versatility of this approach by associating HRP with Lipid-Raft derived nanoparticles from human placenta-derived mesenchymal stromal cells. This work should pave the way for the efficient loading of a therapeutic anti-RAS scFv to EVs, before functional delivery in tumoral cells.