Surveillance épidémiologique des virus enveloppés émergents dans les eaux usées : importance de la qualité et de l’intégrité du génome viral

Epidemiological surveillance of emerging enveloped viruses in wastewater: importance of viral genome quality and integrity

• Auteur / Autrice : Ahlam Chaqroun
• Direction : Isabelle Bertrand, Christophe Gantzer
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la Vie et de la Santé - BioSE
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 27/02/2025
• Etablissement(s) : Université de Lorraine
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale BioSE - Biologie, Santé, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LCPME - Laboratoire de Chimie Physique et Microbiologie pour les Matériaux et l'Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Microbiologie environnementale
• Jury : Président / Présidente : François Helle
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Bertrand, Jean-Luc Bailly, Sandra Martin-latil, Leslie Ogorzaly, Albert Bosch, Christophe Gantzer
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Luc Bailly, Sandra Martin-latil

Mots clés

Mots clés libres

Génome

Emergence

Virus enveloppés

Eaux usées

Intégrité

Epidémiologie

Genome

Emergence

Enveloped viruses

Wastewater

Integrity

Epidemiology

Résumé

Les épidémies virales récurrentes, telles que la COVID-19, illustrent la menace croissante posée par les virus émergents. Ces pandémies imprévisibles mettent en évidence l’urgence de développer des approches innovantes pour détecter rapidement et gérer efficacement les émergences virales. L’épidémiologie basée sur les eaux usées (WBE) apparaît comme une approche prometteuse, capable de refléter la circulation virale à l’échelle d’une population. Cependant, des défis majeurs subsistent : la faible concentration des virus émergents ou de leurs variants dans cette matrice complexe, la dégradation rapide des génomes viraux et la différenciation entre les génomes détectés et les particules infectieuses. L’objectif principal de cette étude était de développer des méthodes fiables pour isoler les génomes viraux en quantité et pureté suffisantes à partir des eaux usées et d’évaluer leur intégrité afin de permettre à plus long terme des analyses plus avancées de la variabilité génétique de ces virus et de leur risque infectieux dans l’environnement. Dans un premier temps, nous avons évalué la faisabilité du séquençage ultra-profond short reads sur des échantillons d’eaux usées et de patients de la même zone urbaine. Les résultats ont démontré que les eaux usées reflètent précisément le changement des variants de SARS-CoV-2 observés chez les patients. Cette surveillance a révélé des cas d’individus porteurs de mélanges de variants, soulignant le risque potentiel de co-infection ou d’événements de recombinaison susceptibles de conduire à l’émergence de nouveaux variants préoccupants. Ces observations ont mis en évidence la nécessité d’une surveillance à l’échelle de la population des recombinants via les eaux usées. Cependant, des optimisations méthodologiques restaient nécessaires, notamment pour répondre aux faibles concentrations d’ARN viral et au problème de dégradation de l’ARN dans cette matrice. En réponse à ces besoins, ce travail a amélioré la procédure globale d’isolement de l’ARN en quantité et pureté suffisantes pour le séquençage. Cette optimisation a permis de développer une méthode efficace pour le séquençage short reads de l’ensemble du génome de SARS-CoV-2, même à très faibles concentrations. Par ailleurs, pour des approches plus avancées telles que le séquençage long reads, il est essentiel d’inclure une évaluation de l’intégrité de l’ARN. À cet égard, la phase finale de cette étude s’est concentrée sur l’intégrité de l’ARN viral. Une méthode 2-step LR-RT-dPCR a été développée et validée, révélant que l’intégrité de l’ARN dépend de multiples facteurs environnementaux et intrinsèques qui doivent être pris en compte. Cependant, ces avancées ont également mis en lumière des défis persistants : la prédominance des particules non infectieuses dans les eaux usées, et même dans des échantillons moins complexes, peut masquer les génomes intacts associés aux particules infectieuses. Par conséquent, le développement de méthodes pour capturer spécifiquement les particules infectieuses reste essentiel pour évaluer avec précision l’intégrité des génomes viraux. Cela permettrait non seulement de garantir des analyses moléculaires optimales, mais aussi de témoigner de la présence de génomes intacts, potentiellement issus de particules virales infectieuses. En conclusion, cette thèse propose des méthodologies innovantes pour renforcer la surveillance épidémiologique des virus émergents. Bien que développées pour le SARS-CoV-2, ces approches peuvent être transférables à d’autres agents pathogènes, posant ainsi les bases d’une épidémiologie environnementale plus résiliente et efficace. Ce travail souligne l’importance des avancées technologiques et des collaborations interdisciplinaires pour mieux protéger les populations contre les menaces virales futures.

Recurrent viral epidemics, such as COVID-19, highlight the growing threat posed by emerging viruses. These unpredictable pandemics underscore the urgency of developing innovative approaches for rapidly detecting and effectively managing viral emergence. Wastewater-based epidemiology (WBE) has emerged as a promising approach, capable of reflecting viral circulation at a population level. However, important challenges remain: the low concentration of emerging viruses or their variants in this complex matrix, the rapid degradation of viral genomes, and the difficulty of distinguishing detected genomes from infectious particles. The main objective of this study was to develop reliable methods to isolate viral genomes in sufficient quantity and purity from wastewater and assess their integrity. This would enable, in the longer term, advanced analyses of the genetic variability of these viruses and their infectious risks in the environment. Initially, we evaluated the feasibility of ultra-deep sequencing using short reads on wastewater and patient samples from the same urban area. The results demonstrated that wastewater accurately reflects the changes in SARS-CoV-2 variants observed in patients. This monitoring revealed cases of individuals carrying mixtures of variants, highlighting the potential risks of co-infection or recombination events that could lead to the emergence of new variants of concern. These findings underscored the need for population-level surveillance of recombinants through wastewater analysis. Nevertheless, methodological optimizations were required, particularly to address the low concentrations of viral RNA and the issue of RNA degradation in this matrix. In response to these challenges, this work improved the overall procedure for isolating RNA in sufficient quantity and purity for sequencing. These optimizations enabled the development of an efficient method for short-read sequencing of the full SARS-CoV-2 genome, even at very low concentrations. Moreover, for more advanced approaches such as long-read sequencing, assessing RNA integrity is critical. In this regard, the final phase of this study focused on viral RNA integrity. A 2-step LR-RT-dPCR method was developed and validated, revealing that RNA integrity depends on multiple environmental and intrinsic factors that must be considered. However, these advancements also highlighted persistent challenges: the predominance of non-infectious particles in wastewater, and even in less complex samples, can obscure intact genomes associated with infectious particles. Therefore, developing methods to specifically capture infectious particles remains essential for accurately evaluating the integrity of viral genomes. This would not only ensure optimal molecular analyses but also confirm the presence of intact genomes potentially derived from infectious viral particles. In conclusion, this thesis proposes innovative methodologies to enhance the epidemiological surveillance of emerging viruses. While developed for SARS-CoV-2, these approaches could be transferable to other pathogens, laying the groundwork for a more resilient and effective environmental epidemiology. This work underscores the importance of technological advancements and interdisciplinary collaborations in better protecting populations from future viral threats.