Identification de nouveaux régulateurs non canoniques de l'épissage alternatif médié par la chromatine pertinents pour la transition épithélialo-mésenchymateuse

Identification of novel non-canonical regulators of chromatin-mediated alternative splicing relevant for the epithelial-to-mesenchymal transition

• Auteur / Autrice : Tristan Espie--caullet
• Direction : Philippe Pasero, Reini Fernandez de luco
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2021
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IGH - Institut de Génétique Humaine
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Composante Epigénétique de l'Epissage Alternatif

Mots clés

Mots clés libres

Transition épithelio-mesenchymateuse

Épissage alternatif

Épigénétique

CRISPR-Cas9

Epithelial-to-mesenchymal transition

Alternatif splicing

Epigenetics

CRISPR-Cas9

Résumé

L'épissage alternatif (EA) des pré-ARNm est un processus important pour l'identité cellulaire et à la diversité des protéines. Cependant, la dérégulation de l'EA peut conduire à la formation de maladies. En particulier, au cours de la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), un processus impliqué dans les métastases, dont les changements d'EA sont essentiels pour le phénotype invasif. Comprendre la régulation de l'EA conduira à des thérapies innovantes. Récemment, nous avons découvert un nouveau rôle des marques d'histones H3K27ac dans la régulation de l'EA dans l'EMT. Cependant, les mécanismes sous-jacents sont peu connus. L'objectif de ma thèse est d'identifier les régulateurs chromatiniens impliqués dans ces dynamiques d'EA induites par l'EMT. Dans ce but, nous avons choisi une approche de criblage génomique CRIPSR dans laquelle les ARNg induisant un changement d'EA seraient sélectionnés par tri cellulaire avec des anticorps spécifiques reconnaissant uniquement l'isoforme mésenchymale de CTNND1. Grâce à cela, j'ai identifié plusieurs protéines de liaison à l'ADN et à l'ARN, ainsi que des protéines liées au cytosquelette et au calcium n'étant pas connu pour impacter l'EA. Plusieurs sont liés à la formation d'hybrides ADN-ARN (R-loop), et pas encore associés à l'EMT. Les résultats préliminaires obtenus à l'aide de données publiques et le traitement des cellules avec la camptothécine ont mis en évidence un effet fonctionnel de la formation des R-loop sur l'EA de plusieurs gènes de l'EMT. En outre, nous avons des preuves du rôle de l'organisation 3D de la chromatine dans l'EA de CTNND1, avec la liaison de plusieurs de nos régulateurs chromatiniens candidats à des régions distales interagissant en 3D. J'émets donc l'hypothèse d'un nouveau mécanisme de régulation globale de l'EA orchestré par le remodelage de la chromatine via la formation de R-loop, qui serait pertinent pour l'EMT et l'acquisition d'un phénotype invasif par les cellules cancéreuses épithéliales.

Alternative splicing (AS) is an important process contributing to cell-type identity and protein diversity. However, its misregulation can lead to disease. In particular, during the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), a developmental process strongly implicated in metastasis, with dynamic changes in splicing essential for the invasive phenotype. Understanding this splicing regulation will lead to innovative therapies. Recently, we have uncovered a new role for specific histone marks, such as H3K27ac, in inducing highly dynamic splicing changes essential for EMT. However, little is known about the mechanisms behind it. The objective of my PhD is to identify the chromatin regulators involved in these EMT-induced splicing dynamics. To this aim, we chose an unbiased CRIPSR genomic screening approach in which gRNAs inducing a change in splicing would be selected by cell sorting with specific antibodies recognizing only the mesenchymal isoform of CTNND1. Thanks to this novel approach, I have identified several chromatin and RNA-binding proteins, together with cytoskeleton- and calcium-related proteins, not known to impact splicing. Amongst the candidate genes, several proteins are related to DNA-RNA hybrid (R-loop) formation, which have not been linked to EMT yet. Preliminary results with publicly available data on these R-loop-associated proteins, and treatment of our epithelial cells with camptothecin pointed to a strong functional effect of R-loop formation in the splicing of several EMT-dependent genes. Furthermore, we also have strong evidence of a role for 3D chromatin organization in CTNND1 splicing, with the binding of several of our candidate chromatin regulators at 3D interacting distal regions. I thus hypothesize a new mechanism of global AS regulation orchestrated by chromatin remodeling through R-loop formation relevant for EMT and the acquisition of a more invasive phenotype by epithelial cancer cells.