Décryptage des mécanismes moléculaires de la persistance du virus de l'hépatite B

Deciphering the molecular mechanisms of hepatitis B virus persistence

• Auteur / Autrice : Basile Jay
• Direction : Christine Neuveut
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le 31/08/2021
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IGH - Institut de Génétique Humaine
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Virologie Moléculaire

Mots clés

Mots clés libres

Virus de l'hépatite B

Chromatine virale

Persistance du virus de l'hépatite B

Hepatitis B virus

Viral chromatin

Hepatitis B virus persistence

Résumé

L'infection chronique par le virus de l'hépatite B (VHB) augmente fortement le risque d'hépatocarcinome. Les traitements antiviraux actuels ne sont pas curatifs car ils ne permettent pas d'éliminer l'ADN viral nucléaire (ADNccc) qui est responsable du rebond viral à l'arrêt des traitements. Cet ADN sert de matrice à la transcription des ARNs viraux dont l'ARN prégenomique qui est encapsidé et rétrotranscrit en ADN dans le cytoplasme, créant ainsi un cycle de renouvellement de l'ADN viral. Le projet développé au cours de cette thèse vise à identifier les facteurs cellulaires et viraux interagissant avec l'ADN du virus afin de comprendre leurs rôles dans la biogenèse de l'ADN viral qui couvrent des mécanismes de réparation, d'expression et de maintien de cet ADN au sein des cellules infectées. Une meilleure compréhension de ces mécanismes est nécessaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à éliminer le virus. Dans ce but nous utiliserons une nouvelle méthode qui permet d'identifier par spectrométrie de masse les protéines associées à un fragment de chromatine donné isolé par capture par affinité en utilisant des sondes spécifiques de ce fragment composées d'un analogue d'acide nucléique synthétique (Desthiobiotine-TEG-spacer phosphoramidite 18-49pb de fluro-ARN – dernière pb d'ADN) qui permet une plus grande stabilité et sensibilité d'hybridation. Cette méthode appelée PICh a été initialement développée pour des séquences répétées de la cellule telles que les séquences télomériques mais a également, été utilisée avec succès dans le laboratoire sur l'ADN non intégré du virus de l'immunodéficience humain. Nous nous proposons d'identifier les protéines interagissant avec l'ADN du VHB à différente phase de l'infection : lors de sa translocation vers le noyau, de son établissement nucléaire et de sa transcription. Nous utiliserons deux modèles : des cellules d'hépatomes en culture infectées par le VHB mais également des hépatocytes humains issus de foie de souris humanisées pour le foie. Les résultats des deux analyses seront recoupés afin de sélectionner les protéines candidates puis celles-ci seront étudiées d'un point de vue biochimique. Nous confirmerons leur interaction avec l'ADN viral, à partir des extraits issus du PICh par western blot, par immunoprécipitation de la chromatine puis nous déterminerons l'éventuelle présence de ces protéines candidates au sein de complexes par fractionnement sur gradient de glycérol. Nous confirmerons leur rôle sur la réplication virale par des expériences d'extinction ou de surexpression de ces protéines en culture cellulaire et dans le modèle de souris humanisées. L'étape du cycle virale mise en jeu sera évaluée par la quantification des différentes formes de l'ADN viral, par mesure de l'activité transcriptionnelle virale et par mesure de la quantité de virus libérée ainsi que de la sécrétion d'antigènes viraux. Ces résultats nous permettrons de mieux comprendre la formation de l'ADN viral et son maintien dans le noyau de la cellule hôte.

Chronic hepatitis B virus (HBV) infection strongly increases the risk of hepatocarcinoma. Current antiviral treatments are not curative because they do not eliminate the nuclear viral DNA (cccDNA) that is responsible for a viral rebound when treatment is stopped. This DNA serves as a matrix for the transcription of viral RNAs, including the pregenomic RNA, which is encapsidated and retrotranscribed into DNA in the cytoplasm, thus creating a viral DNA renewal cycle. The project developed during this Ph.D. aims at identifying cellular and viral factors interacting with the virus DNA in order to understand their roles in the biogenesis of the viral DNA, which covers the mechanisms of repair, expression and maintenance of this DNA within the infected cells. A better understanding of these mechanisms is necessary to develop new therapeutic strategies to eliminate the virus. To this end, we will use a new method that allows the identification, by mass spectrometry, of proteins associated with a given chromatin fragment isolated by affinity capture. This method uses specific probes composed of a synthetic nucleic acid analog (Desthiobiotin-TEG-spacer phosphoramidite 18-49 bp of fluro-RNA - last bp of DNA) that allows greater stability and sensitivity of the hybridization. This method called PICh was initially developed for repeated sequences of the cell such as telomeric sequences but has been successfully used in the laboratory on non-integrated DNA of human immunodeficiency virus. We propose to identify the proteins interacting with HBV DNA at different phases of infection: during translocation to the nucleus, nuclear establishment and transcription. We will use two models: cultured hepatoma cells infected with HBV and human hepatocytes derived from liver humanized mice. The results of both analyses will be cross-checked to select candidate proteins and then these will be studied from a biochemical point of view. We will confirm their interaction with viral DNA, from the extracts of the PICh by western blot, by chromatin immunoprecipitation and we will determine the possible presence of these candidate proteins in complexes by fractionation on a glycerol gradient. We will confirm their role on viral replication by experiments of extinction or overexpression of these proteins in cell culture and in the humanized mouse model. The viral cycle stage involved will be evaluated by quantifying the different forms of viral DNA, by measuring the viral transcriptional activity and by measuring the amount of virus released as well as the secretion of viral antigens. These results will allow us to better understand the formation of viral DNA and its maintenance in the host cell nucleus.