Etude fonctionnelle et structurale du transporteur de multiple drogues, BmrA, en condition d’équilibre et en temps résolu. Caractérisation structurale de BmrA en liposome par cryoEM

Functional and structural studies of the multidrug transporter, BmrA, under equilibrium and time-resolved conditions. Structural characterization of BmrA in liposomes by Cryo-EM

• Auteur / Autrice : Loïck Moissonnier
• Direction : Vincent Chaptal, Pierre Falson
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 08/11/2024
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Molecular Microbiology and Structural Biochemistry (Lyon ; 1999-....)
• Jury : Président / Présidente : Martin Picard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Vincent Chaptal, Pierre Falson, Sandrine Boschi-Muller, Isabelle Broutin, Ofelia Maniti
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sandrine Boschi-Muller, Isabelle Broutin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bacillus subtilis

Cryomicroscopie

Résistance aux antibiotiques

Transporteurs ABC

Mots clés libres

CryoEM en temps résolu

Enzymologie structurale

Liposome

Protéine membranaire

Dynamique

Time-Resolved cryoEM

Structural enzymology

Liposome

Membrane protein

Dynamic

Résumé

Selon l’organisation mondiale de la santé, la résistance aux antibiotiques est un problème majeur pour l’humanité en raison de l’émergence de bactérie multi-résistantes. L’émergence de ces résistances chez les bactéries provient du fait qu’elles sont capables de mettre en place de nombreuses stratégies pour empêcher les antibiotiques de fonctionner. En particulier, la première ligne de défense de ces bactéries est la surexpression de transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) qui expulsent les antibiotiques en dehors de la cellule bactérienne, diminuant leurs concentrations sous leurs seuils de cytotoxicité. Plus de 50 ans d’étude sur ces transporteurs ont permis à la communauté scientifique d’établir un mécanisme global, notamment grâce à l’acquisition de structures 3D de plus en plus nombreuses. Ceci a été intimement lié par l’évolution technologique et méthodologique de la biologie structurale ces dernières années avec notamment l’émergence de la cryoEM. Plus les connaissances avancent plus les questions deviennent précises, et il demeure toujours de nombreuses questions sur la compréhension de leur fonctionnement. Dans le cadre de mon projet, j’ai étudié BmrA, l’un de ces transporteur ABC exprimé chez Bacillus subtilis qui lui confère une résistance à la cervimycine C, un antibiotique sécrété par Streptomyces tendae son compétiteur naturel dans le même biotope. De plus, ce transporteur est capable de fixer et de transporter une grande variété de molécules dont de nombreux antibiotiques en adoptant à la fois une conformation prenant en charge le ligand (IF, conformation ouverte vers l’intérieur de la cellule), et une conformation ouverte vers l’extérieur de la cellule (OF) pour le relarguer. Cette capacité de manipuler plusieurs molécules reste une question très discutée, surtout dans la compréhension du mécanisme de transport au niveau moléculaire. Au cours de ma thèse, j’ai participé à une étude d’enzymologie structurale sur un mutant inactif E504A en présence de ligands (Rhodamine 6G, Hœchst 33342) afin d’améliorer les connaissances sur ce mécanisme. Ces ligands jouent un rôle d’effecteur allostérique sur la fixation d’ATP de BmrA, impactant la transition entre les conformations IF et OF. La résolution de plusieurs structures 3D par cryoEM a été réalisé en variant la concentration d’ATP. Une analyse de la flexibilité de chacune de ces conformations a mis en lumière les réarrangements moléculaires que BmrA peut adopter pour assurer sa poly-spécificité. De plus, j’ai apporté de nombreuses informations fonctionnelles en ce qui concerne le couplage entre le transport du ligand et l’activité ATPasique de ce transporteur. La deuxième partie de mes travaux repose sur l’étude de la transition conformationnelle se produisant chez BmrA après la fixation d’ATP à l’aide de techniques dites « en temps résolu ». L’objectif a été de suivre ces changements conformationnels au cours du temps grâce à la fluorescence intrinsèque de BmrA couplée à la cryoEM. J’ai développé et optimisé les conditions expérimentales pour réaliser cette étude, et notamment acquis des informations cinétiques et dynamiques sur des mutants ainsi que la protéine sauvage.Enfin, la dernière partie du manuscrit a consisté à reconstituer BmrA dans un environnement amphipathique plus natif que les détergents afin d’acquérir sa structure 3D par cryoEM. J’ai optimisé ce protocole de reconstitution pour obtenir le meilleur échantillon possible à déposer sur grille. Au cours de ce processus, j’ai caractérisé la formation du protéoliposome à chaque étape du protocole en l’observant par cryoEM. Grâce à cette étude, j’ai pu obtenir les premières classes 2D de BmrA en bicouche lipidique. En conclusion, cette thèse offre une nouvelle façon d’étudier la relation structure-fonction des protéines en développant des outils et une méthodologie d’enzymologie structurale pour visualiser la dynamique de ce transporteur ABC, ainsi qu’une première approche pour l’étudier en liposome.

According to the World Health Organization, antibiotic resistance is a major problem for humanity due to the emergence of multiresistant bacteria. The emergence of these resistances in bacteria is due to their ability to implement numerous strategies to prevent antibiotics from working. In particular, the first line of defense of these bacteria is the overexpression of ABC (ATP-Binding Cassette) transporters, which expel antibiotics out of the bacterial cell, reducing their concentrations below their cytotoxic thresholds. Over 50 years of study on these transporters have enabled the scientific community to establish a global mechanism, particularly thanks to the increasing acquisition of 3D structures. This has been closely linked to the technological and methodological evolution of structural biology in recent years, especially with the emergence of cryoEM. As knowledge advances, the questions become more precise, and many questions remain about understanding their functioning. As part of my project, I studied BmrA, one of these ABC transporters expressed in Bacillus subtilis, which confers resistance to cervimycin C, an antibiotic secreted by Streptomyces tendae, its natural competitor in the same biotope. Additionally, this transporter is capable of binding and transporting a wide variety of molecules, including many antibiotics, by adopting both a conformation that takes up the ligand (IF, inward-facing conformation) and an outward-facing conformation (OF) to release it. This ability to handle multiple molecules remains a highly debated question, especially in understanding the transport mechanism at the molecular level. During my Ph.D., I participated in a structural enzymology study on an inactive E504A mutant in the presence of ligands (Rhodamine 6G, Hoechst 33342) to improve knowledge of this mechanism. These ligands act as allosteric effectors on the ATP binding of BmrA, impacting the transition between IF and OF conformations. The resolution of several 3D structures by cryoEM was achieved by varying the concentration of ATP. An analysis of the flexibility of each of these conformations highlighted the molecular rearrangements that BmrA can adopt to ensure its polyspecificity. Moreover, I provided numerous functional insights regarding the coupling between ligand transport and the ATPase activity of this transporter. The second part of my work focused on studying the conformational transition occurring in BmrA after ATP binding using so-called ''time-resolved'' techniques. The objective was to monitor these conformational changes over time using the intrinsic fluorescence of BmrA coupled with cryoEM. I developed and optimized the experimental conditions to conduct this study, particularly acquiring kinetic and dynamic information on mutants as well as the wild-type protein. Finally, the last part of the manuscript involved reconstituting BmrA in a more native amphipathic environment than detergents to obtain its 3D structure by cryoEM. I optimized this reconstitution protocol to obtain the best possible sample for grid deposition. During this process, I characterized the formation of the proteoliposome at each stage of the protocol by observing it with cryoEM. Thanks to this study, I was able to obtain the first 2D classes of BmrA in a lipid bilayer. In conclusion, this thesis offers a new way to study the structure-function relationship of proteins by developing structural enzymology tools and methodology to visualize the dynamics of this ABC transporter, as well as a first approach to studying it in liposomes.