Génération et caractérisation du nouveau modèle murin d'hidrosadénite suppurée

Generation and characterization of new hidradenitis suppurativa mouse model

• Auteur / Autrice : Vanessa Hoang Quang
• Direction : Sophie Hue
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Pathologie et recherche clinique
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2021
• Etablissement(s) : Paris 12
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Sciences de la Vie et de la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Mondor de Recherche Biomédicale (Créteil)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Equipe LEVY - Physiopathologie et immunothérapies dans l'infection VIH

Mots clés

Mots clés libres

Follicule pileux

Hidradénite suppurée

Inflammation

Souris

Hair follicle

Hidradenitis suppurativa

Inflammation

Mouse

Résumé

L'hidrosadénite suppurée (HS) ou maladie de Verneuil est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui affecte 1% de la population française. Les lésions se présentent sous forme d'abcès et de fistules très douloureux dans les zones riches en poils, notamment les aisselles et la zone périnéale. Il s'agit de la pathologie dermatologique, qui présente le retentissement le plus important sur la vie psycho-affective et socio-professionnelle du patient. La physiopathologie de l'HS est mal connue, cependant une atteinte du follicule pileux serait à l'origine de la maladie. Une inflammation périfolliculaire conduit à une hyperplasie et une hyperkératose infundibulaire (partie la plus superficielle des follicules pileux). Cela induit la formation de kystes qui se dilatent puis se rompent, libérant ainsi leur contenu dans le derme. Les fibres de kératine et le microbiote cutané activent le système immunitaire ce qui conduit à l' inflammation. Actuellement, il n'existe pas de traitement efficace et curatif, ce qui impacte fortement la qualité de vie des patients, faisant d'elle une vulnérabilité, un enjeu et un coût sociétaux majeurs. l'HS a une origine multifactorielle (génétique, mode de vie, frictions cutanées) et est généralement accompagnée de comorbidités (syndrome métabolique, maladies cardiovasculaires). Notre équipe de recherche s'intéresse à des cellules du follicule pileux, ayant des caractéristiques de cellules souches, que l'on appelle Outer Root Sheath Cells pour ORS. Ces cellules sont à l'origine de la formation du poil. Nous avons montré que les ORS des patients HS (ORS-HS) sécrètent spontanément IP-10 et RANTES qui sont capables de recruter les cellules immunitaires (Hotz et al, Journal of Investigative Dermatology, 2016). Nos résultats récents suggèrent qu'une anomalie de différenciation du follicule pileux, dont le reflet est la perte de la population des cellules souches quiescentes du bulge, pourrait être à l'origine de l'hidradénite suppurée (Orvain et al, JCI, 2020). Dans ce projet, nous allons nous concentrer sur deux aspects de la maladie: le facteur génétique et les cellules souches folliculaires (CSF). En effet, les cas familiaux représentent 30-40% des patients HS. Les mutations sont principalement détectées dans les gènes codant pour la 𝛾-sécrétase, un complexe protéasique transmembranaire, impliquée dans l'homéostasie cellulaire via la voie Notch. L'inactivation de la nicastrine (Ncstn) dans une lignée épithéliale HACAT induit l'augmentation de la prolifération et la différenciation de ces cellules ainsi que la synthèse de molécules inflammatoires. A partir de ces éléments, notre hypothèse est que la perte de la 𝛾-sécrétase dans les CSF affecterait leur prolifération et leur différenciation, résumant, en partie, la physiopathologie de l'HS. Pour confirmer notre hypothèse, nous souhaitons réaliser un modèle murin de l'HS qui récapitule la maladie. L'objectif du projet est donc de concevoir un modèle souris robuste de l'HS. Dans un premier temps, nous ferons une analyse détaillée du modèle murin (Krox20Cre/+, Ncstnflox/flox, Rosa26Tom), où la délétion de la Ncstn est introduite dans les cellules qui expriment Krox20 comme les CSF. Dans un deuxième temps, nous l'utiliserons pour décrypter le rôle des facteurs environnementaux (tabac, dysbiose, obésité) dans le développement de l'HS. Partie 1: Génération et Caractérisation cellulaire et moléculaire du modèle murin HS Nous générerons les souris Krox20Cre/+, Ncstnflox/flox, Rosa26Tom délétées pour la Ncstn, une sous-unité régulatrice de la 𝛾-sécrétase, spécifiquement dans les CSF, grâce au système Cre-Lox constitutive. L'astuce ajoutée est que les CSF dont le gène de la Ncstn est délété seront rouges, grâce à l'expression du rapporteur Tomato, permettant ainsi un suivi facilité de celles-ci. Les contrôles dans ce projet sont les souris Krox20Cre/+, Rosa26Tom/+ (sauvages ou wild-type) et Krox20Cre/+, Ncstnflox/+, Rosa26Tom/+. 2-3 souris de chaque groupe seront sacrifiées pour étudier les CSF. Nous analyserons et caractériserons le profil phénotypique cellulaire des CSF par des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) et de cytométrie de flux. Nous déterminerons l'impact de la perte de la Ncstn sur leur différenciation, leur migration et leur prolifération cellulaire, ainsi que sur leur profil inflammatoire. En parallèle, nous les étudierons au niveau moléculaire, par une analyse transcriptomique et épigénétique. Dans un second temps, nous examinerons les conséquences de la suppression de la Ncstn sur les interactions entre CSF et cellules immunitaires par des analyses transcriptomiques sur cellule unique en collaboration avec l'équipe du professeur Topilko. Ainsi, nous démontrerons si la perte de la 𝛾-sécrétase dans les CSF est suffisante pour induire un phénotype proche de celui de l'HS chez la souris. Partie 2: Décryptage du rôle des facteurs environnementaux dans le développement de l'HS Nous générons également les mêmes souris, cependant nous utiliserons le système Cre-Lox inductible (Krox20CreERT2/+, Ncstnflox/flox, Rosa26Tom), dans le but de contrôler la zone et la temporalité de la délétion, via l'application locale de tamoxifène. Cela permettra une amélioration à notre modèle. Une validation sera effectuée, comme décrite dans la partie 1. Ensuite, nous étudierons l'impact de trois facteurs environnementaux sur la maladie: le tabac et la nicotine : les souris seront soumises à la fumée de 10 cigarettes/heure, 2 heure/jour durant 5 jours. la dysbiose : les souris mangeront de la nourriture stérile et boiront de l'eau supplémentée en antibiotiques, afin d'éliminer les microbiotes intestinal et cutané. l'obésité : les souris mutantes connaîtront un régime hypercalorique (5243 kcal/kg : 60% lipides, 20% de glucides et de protéines), contrairement aux contrôles qui se nourriront normalement (2830 kcal/kg : 13.5% lipides, 61.3% glucides et 25.2% protéines). A l'issue de ces conditions, une caractérisation cellulaire et moléculaire sera faite, selon les techniques de la partie 1. Nous souhaitons déterminer si certains facteurs environnementaux supplémentaires à l'inactivation de la 𝛾-sécrétase peuvent avoir un impact sur le développement des lésions, mais également sur les interactions entre CSF et système immunitaire.Conclusion Notre but est de créer un nouveau modèle murin expérimental, afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques à l'origine de l'hidrosadénite suppurée. En effet, à l'heure actuelle, l'étude de la maladie se fait majoritairement à travers les patients, ce qui est limitant. De plus, l'hétérogénéité des patients rend les résultats peu reproductibles et peu robustes. Ce nouveau modèle murin nous permettra, à terme, l'identification de nouveaux gènes et voies candidats, de même que des nouveaux biomarqueurs inflammatoires, encore non identifiés chez l'homme. Nos résultats pourront ainsi servir à établir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Affecting 1 to 4% of people, mainly young one and women, hidradenitis suppurativa (HS) is a chronic painful inflammatory skin disease. It specifically takes place in the intimate skin folds, such as armpits, groin and anogenital areas. Instead of a phenotypic heterogeneity, it's believed that the vicious cycle begins with an initial perifollicular inflammation, due to keratinocyte dysregulation. It leads to formation of cysts which dilate and can be broken, releasing their content into the dermis. This event chronically triggers multiple inflammatory pathways and immune system, leading to sinus tract and scar formation in more severe cases. Currently, there is no effective and healing treatment, impacting dramatically the patient's quality of life, making it a vulnerable disability and having a big societal issue and cost. Even though its physiopathological mechanisms are still poorly understood, HS is known to have a multifactorial origin and risk factors: genetics, smoking, gut and skin dysbiosis and obesity. In this PhD project, we are going to focus on two aspects of HS: the genetic factor and the hair follicles stem cells (HF-SCs). On the one hand, a positive family history is observed in 30-40% of the HS patients. Mutations are mainly detected in genes coding for y-secretase, a transmembrane multisubunit protease, which is involved in cell homeostasis through Notch pathway. Its inactivation induces an increase of keratinocyte proliferation and differentiation, accompanied by a pro-inflammatory profile. On the other hand, previous studies, including ours, have demonstrated the same observation with patients' hair follicle stem cells, suggesting HS is a follicular disease. The goal of this project is to conceive a robust mouse model of the HS disease. We hypothesize that the inactivation of y-secretase in HF-SCs affects their proliferative activity and differentiation potential and recapitulates, at least partly, the pathophysiology of HS. To achieve this study, 2 work packages will be performed. In WP1, we will perform detailed analysis of the mouse model (Krox20Cre, Ncstnflox/flox, Rosa26Tom). In WP2, we will use this mouse model for deciphering the role of environmental (pollution, obesity) factors as triggers promoting HS. We will generate Krox20Cre, Ncstnflox/flox, Rosa26Tom mice. The goal is to simultaneously target y-secretase deletion and constitutive expression of fluorescent reporter Tomato to HF-SC. Such a strategy should allow us to identify, purify and manipulate y-secretase-/- HF-SCs and all their derivatives thanks to the expression of Tomato reporter. From those mouse models, we will evaluate, whether i) the y-secretase loss is sufficient to trigger the pathogenesis, and ii) whether added environmental hits can trigger or accelerate or accentuate the HS lesion development. Our final aim is to create a new experimental model to have a better understanding of this disease by identifying new candidate genes and pathways, as well as new inflammatory biomarkers, yet undiscovered in human beings.