Rôle conjoint des canaux calciques mécanosensibles lors de la perte de la stabilité endothéliale dans les angiomes caverneux cérébraux CCM et développement d’un modèle CCM dans l’oeuf embryonné

Combined role of mechanosensitive calcium channels in the loss of endothelial stability in Cerebral Cavernous Malformations (CCM) and development of a new CCM model on the chick embryo for fundamental research & high throughput drug screening

• Auteur / Autrice : Candice Pasquier
• Direction : Eva Faurobert
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 12/11/2024
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IAB : Institute for Advanced Biosciences (UGA / Inserm U1209 / CNRS UMR 5309)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Cell Adhesion Dynamics & Differentiation - Dynamique de l'adhésion cellulaire et differentiation - C. ALBIGES RIZO
• Jury : Président / Présidente : Emmanuelle Tillet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Eva Faurobert, Vincent Fleury, Anna Rita Cantelmo, Aubin Penna, Stéphanie Guey
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Vincent Fleury, Anna Rita Cantelmo

Mots clés

Mots clés libres

Angiome caverneux

Membrane chorioallantoïdienne

Canaux calciques

Modélisation de Maladie

Criblage pharmacologique

Cerebral Cavernous Malformations

Chorioallantoic membrane

Calcium channels

Disease Model

Drug screening

Résumé

Les angiomes caverneux CCM (Cerebral Cavernous Malformations) sont des malformations vasculaires cérébrales hémorragiques qui affectent 0,5% de la population mondiale. Ces angiomes sont des empilements de vaisseaux tortueux et dilatés pouvant mesurer plusieurs centimètres dans le cerveau. Des mutations perte de fonction sur 3 gènes, ccm1-3, sont responsables de la forme familiale mais également de lésions sporadiques. Les manifestations cliniques sont des crises d’épilepsie, des hémorragies ou des déficits neurologiques. Actuellement, la résection chirurgicale est le seul traitement possible car aucun médicament n'est encore disponible malgré les études pré-cliniques menées sur les modèles murins. Ces deux dernières décennies, plusieurs voies de signalisation biochimiques dérégulées dans cette pathologie ont été identifiées dans l’apparition et la progression des lésions. Grâce aux modèles in vitro comme les HUVEC (cellules endothéliales humaines issues de la veine ombilicale) déplétées par siARN ou shARN pour les gènes CCM, il a été montré que le complexe protéique CCM est crucial pour la maintenance de l’équilibre tensionnel entre les adhérences cellule-cellule et les adhérences cellule-matrice dans les cellules endothéliales (EC, Endothelial Cell). Cependant, peu d’attention a été portée sur le rôle de l’environnement mécanique des lésions CCM, alors qu’elles apparaissent spécifiquement dans les capillaires veineux à faible flux sanguin et que des études ont montré que l’application de fort flux avait un effet protecteur. Dans cette thèse, nous démontrons d’abord pour la première fois dans le contexte des CCM une surexpression et suractivation des canaux calciques de la famille des TRPV et PIEZO, activés par des stimuli mécaniques comme les forces de cisaillement du flux sanguin, l’étirement de la membrane cellulaire ou la rigidité de la matrice extra-cellulaire. En déplétant ces canaux par siARN dans les EC déplétées de CCM2, nous démontrons qu’ils ont des rôles distincts et complémentaires dans les divers défauts cellulaires causés par la perte de CCM2. TRPV4 joue un rôle dans le changement de programme transcriptionnel déclenché par le silencing de CCM2 et le phénotype sénescent sous-jacent. PIEZO1 et TRPV4 modulent l’intégrité des jonctions cellule-cellule tandis que PIEZO1 et TRPV2 régissent la capacité invasive des EC déplétées en CCM2. La synergie entre ces mécanorécepteurs est encore largement inexplorée, en particulier dans le contexte des maladies vasculaires. Leur dérégulation pourrait être à l’origine de l’incapacité des EC mutées pour CCM2 de s’adapter à leur environnement mécanique et donc à la formation des lésions CCM dans les vaisseaux à faible flux. Nous nous intéressons dans un second temps à l’établissement d’un nouveau modèle d’étude de la maladie CCM. Si les modèles murins ont montré leur validité, leur mise en œuvre est longue et couteuse, ce qui constitue un frein pour l’essor massif de nouvelles thérapies. Nous avons adapté le modèle de la membrane chorioallantoidienne (CAM) de l’œuf de poule embryonné, une membrane extra-embryonnaire avec une importante vascularisation utilisée comme plateforme de xénogreffe de cellules, tissus, ou autres biomatériaux. En greffant des HUVEC sur la CAM, nous rapportons que seulement les cellules mutées pour CCM2 forment des structures semblables à des vaisseaux et déclenchent des anomalies vasculaires sur la CAM sous la forme de vaisseaux dilatés hémorragiques. Le traitement par fasudil, un inhibiteur des kinases ROCK précédemment envisagé comme piste thérapeutique dans le traitement des CCM, permet de diminuer les anomalies vasculaires causées par la greffe de ces cellules mutées, renforçant la pertinence de notre modèle. Ainsi, nous présentons des premiers résultats suggérant l’utilisation de la CAM comme nouveau modèle dans le criblage de composés thérapeutiques pour le traitement des CCM.

Cerebral Cavernous Malformations (CCMs) are hemorrhagic cerebral vascular malformations that affect 0.5% of the global population. These angiomas consist of clusters of tortuous and dilated vessels that can measure several centimeters and form anywhere in the brain. Loss-of-function mutations in three genes, ccm1-3, are responsible for both familial forms and sporadic lesions. Clinical manifestations include seizures, hemorrhage, or neurological deficits. Currently, surgical resection is the only possible treatment, as no drug is available yet despite preclinical studies conducted on mouse models. Over the past two decades, several dysregulated biochemical signaling pathways in CCMs have been identified as playing a role in lesion onset and progression. Using in vitro models like HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) depleted of CCM genes by siRNA or shRNA, it has been shown that the CCM protein complex is crucial for maintaining the tensional balance between cell-cell and cell-matrix adhesions in endothelial cells (ECs). However, little attention has been paid to the role of CCM lesions mechanical environment, even though they specifically appear in low blood flow venous capillaries, and a study has shown that applying high flow has a protective effect on the morphology and transcriptome of CCM-depleted ECs. In this thesis, we start by demonstrating for the first time an overexpression and overactivation of calcium channels from the TRPV and PIEZO families in CCMs, which are known to be activated by mechanical stimuli such as shear stress from blood flow, membrane stretch, or extracellular matrix stiffness. By depleting these channels using small interfering RNAs in CCM2-depleted ECs, we demonstrate that they have distinct and complementary roles in the various cellular defects caused by the loss of CCM2. TRPV4 plays a role in the transcriptional reprogramming triggered by CCM2 silencing and the underlying senescent phenotype. PIEZO1 and TRPV4 modulate cell-cell junction integrity, while PIEZO1 and TRPV2 regulate the invasive capacity of CCM2-depleted ECs. The synergy between these mechanoreceptors remains largely unexplored, especially in the context of vascular diseases. Their dysregulation could explain the inability of CCM2-mutant ECs to adapt to their mechanical environment, leading to the formation of CCM lesions in low-flow vessels. We then focus on establishing a new model for studying CCM disease. While murine models have proven their validity, their implementation is time-consuming and costly, hindering the development of new therapies. We explored the possibility of adapting the chorioallantoic membrane (CAM) model from embryonated chicken eggs, based on the extensive vascularization of this extra-embryonic membrane and its use as a platform for xenografting cells, tissues, or other biomaterials. By grafting HUVECs onto the CAM, we report that only CCM2-mutant cells form vessel-like structures and induce vascular abnormalities on the CAM in the form of dilated and hemorrhagic vessels. Treatment with fasudil, a ROCK kinase inhibitor previously considered a potential therapeutic strategy for CCM treatment, reduces the vascular abnormalities caused by the grafting of these mutant cells, strengthening the relevance of our model. Thus, we present initial results suggesting the use of CAM as a new model for screening therapeutic compounds for CCM treatment.