Étude des effets de composés épigénétiques sur l'infectivité des amastigotes de L. mexicana et identification des gènes différentiellement exprimés impliqués dans ce processus par séquençage de l'ARN

Study of the effects of epigenetic drugs on the infectivity of L. mexicana amastigotes and identification of genes differentially expressed involved in this process by RNA sequencing analysis

• Auteur / Autrice : Rokhaya Thiam
• Direction : Yvon Christian Frédéric Sterkers
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le 15/09/2021
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : MIVEGEC - Maladies Infectieuses et Vecteurs : Ecologie, Génétique, Evolution et Contrôle

Mots clés

Mots clés libres

Trypanosomatides

Leishmania

Infectivité

Épigénétique

Séquençage de l'ARN

CRISPR/Cas9

Trypanosomatids

Leishmania

Infectivity

Epigenetics

RNA sequencing

CRISPR/Cas9

Résumé

Contexte : Leishmania, le parasite responsable des leishmanioses, est un eucaryote unicellulaire divergent présentant de nombreuses caractéristiques cellulaires et moléculaires originales. L'une d'entre elles est l'aneuploïdie en mosaïque, où chaque cellule d'une population cellulaire peut contenir une, deux ou trois copies de chaque homologue chromosomique qui constitue son génome. Pour expliquer les mécanismes de l'aneuploïdie en mosaïque, nous proposons un modèle impliquant une régulation peu orthodoxe de la réplication de l'ADN qui permet la réplication des chromosomes pendant la phase S du cycle cellulaire (revue dans Sterkers et al. Trends Parasitol 2014, Negreira et al. BioRxiv 2020). L'amyloïdie mosaïque est stable dans le temps et transmissible à la plupart des clones cellulaires d'une souche donnée, mais certains clones échappent à cette règle et présentent un nouveau modèle aneuploïde qui est à son tour stable dans le temps et transmissible (Sterkers et al. Cell Microbiol 2011). Cette combinaison de stabilité et de variation de l'héritabilité suggère que l'aneuploïdie en mosaïque est un contrôle sous-épigénétique.Signification:L'aneuploïdie en mosaïque, en plus de son intérêt scientifique en soi, offre également un modèle pertinent pour comprendre comment l'aneuploïdie peut être générée chez les eucaryotes supérieurs. Chez Leishmania, l'expression variée des gènes induite par l'aneuploïdie dans une population de cellules parasites peut être liée à la virulence/pathogénicité et à l'adaptation de l'hôte (Barja et al. Nat Ecol Evol 2017). Cette proposition est donc d'une grande importance pour le domaine et au-delà.Objectifs:Les objectifs principaux de ce projet sont d'identifier des inhibiteurs épigénétiques qui modifient la réplication de l'ADN et l'aneuploïdie en mosaïque, ce qui devrait permettre d'étudier les relations entre la réplication de l'ADN, le paysage chromatinien et l'aneuploïdie en mosaïque chez Leishmania. Méthodes : Le doctorant recherchera des inhibiteurs épigénétiques dans la bibliothèque Tocriscreen. Les phénotypes de perte de fonction seront évalués par les taux de croissance cellulaire et les schémas Nucleus-Kinetoplast, le pourcentage de cellules répliquées par cytométrie de flux bicolore, et la ploïdie par FISH. Un peignage de l'ADN sera effectué pour étudier la dynamique de réplication de l'ADN et SNS-seq pour cartographier les origines de réplication de l'ADN à haute résolution. La force et l'originalité du projet est de combiner les méthodes de cellules uniques (FISH et DNA combing) avec des méthodes à haut débit basées sur NGS (SNS-seq, ChIP-seq ou RNA-seq). De plus, en utilisant CRISPR-Cas9 (Yagoubat et al. Cell Microbiol 2020 ; revu dans Yagoubat et al. Trends Parasitol 2020), nous prévoyons d'obtenir des parasites mutants de protéines spécifiques impliquées dans la réplication de l'ADN et le maintien de la ploïdie ou de protéines impliquées dans l'organisation du paysage chromatinien. L'impact sur la virulence/infectivité des mutants sera également analysé en utilisant des infections de macrophages, de souris et de phlébotomes. Nature du travail collaboratif : Montpellier a été pionnière dans l'identification de l'aneuploïdie en mosaïque chez Leishmania. Elle a une longue expérience en FISH et en peignage d'ADN ; elle a déjà mis en place ChIP-seq et SNS-seq, et a été la première à mettre en œuvre CRISPR-Cas9 dans ces parasites. Grenoble a une longue et fructueuse expérience dans les études épigénétiques chez Toxoplasma, en particulier avec les inhibiteurs épigénétiques (Bougdour et al. J Exp Med 2009).ils aideront à (i) choisir les inhibiteurs à tester selon leur classe, (ii) mettre en place certaines des expériences basées sur NGS et (iii) analyser les données. Le doctorant : Nous recherchons un étudiant motivé, ayant un bon esprit d'équipe, rigoureux scientifiquement et prêt à utiliser un large panel de techniques.

Background:Leishmania,the parasiteresponsible for leishmaniases,is adivergent unicellular eukaryote withmany original cellular and molecular features. One of them is mosaic aneuploidy, whereevery cell in a cell population may contain one, two or three copies of each chromosome homologs that constitute their genome. To explain the mechanisms of mosaic aneuploidy, we propose a model involving an unorthodox regulation of DNA replication that permits re-replication of chromosomes duringtheS phase of the cell cycle (reviewed in Sterkers et al. Trends Parasitol 2014, Negreira et al. BioRxiv 2020).Mosaicaneuploidy is stable in time and transmissible to most cell clones from a given strain, but some clones escape this rule and present a new aneuploid pattern which in turn is stable in time and transmissible (Sterkers et al. Cell Microbiol 2011). This combination of stability and variation in the heritability suggests that mosaic aneuploidyis underepigenetic control.Significance:Mosaic aneuploidy, in addition to its scientific interest per se, also offers a pertinent model for understanding how aneuploidy can be generated in higher eukaryotes. In Leishmania, the variegated gene expression inducedby aneuploidy in a parasite cell population may be linked with virulence/pathogenicity andhost adaptation (Barja et al. Nat Ecol Evol 2017). This proposal is therefore ofgreat importancefor the field and beyond.Objectives:The mainobjectivesof this project are to identify epigenetic inhibitors that alterDNA replication and mosaic aneuploidy, whichshould allow studying the relationships between DNA replication, chromatin landscape and mosaic aneuploidy in Leishmania. Methods:The PhD studentwill screenepigenetic inhibitorsfrom theTocriscreen library. Loss-of-function phenotypes will be assessed by cell growth ratesand Nucleus-Kinetoplast patterns, percentage of replicating cells by two-color flow cytometry, and the ploidyby FISH. DNA combing will be performed to study DNA replication dynamics and SNS-seq to map DNA replication origins with high resolution. The strengthand originalityof theproject is to combine single cell methods(FISH and DNA combing) with high-throughput methodsbased on NGS (SNS-seq, ChIP-seq or RNA-seq). In addition, using CRISPR-Cas9 (Yagoubat et al. Cell Microbiol 2020;reviewed in Yagoubat et al. Trends Parasitol 2020), we plan to obtain mutant parasites of specific proteins implicated in DNA replication and maintenance of ploidyor proteins involved in chromatin landscape organization. Impact on virulence/infectivity of the mutants will also be analyzed using macrophage, mouse and phlebotomine infections. Nature of the collaborative work:Montpellier was pioneer in the identificationof mosaic aneuploidyin Leishmania. It has a long experience in FISH and DNA combing;has already set up ChIP-seq and SNS-seq,andwas the first to implement CRISPR-Cas9in these parasites. Grenoblehas a long-lasting and fruitful experiencein epigenetics studies in Toxoplasma, in particular with epigenetic inhibitors (Bougdour et al. J Exp Med 2009).Theywill help in (i) choosing the inhibitors to be testedaccording to their class, (ii) setting up some of the NGS-based experimentsand (iii) analyzing the data.The PhD student:We are looking for a highly motivated studentwitha good team spirit, scientifically rigorous and who is ready to use a large panelof techniques.Knowledge in Parasitology is not a pre-requisite