Développement d'une métrique pour l'analyse quantitative de la profondeur dans l'imagerie de la porosité dentinaire, un protocole d'imagerie par autofluorescence et son application à des cas pathologiques

Development of a quantitative depth analysis metric in fluorescence imaging of dentin porosity, an autofluorescence imaging protocol and its application to pathological cases

• Auteur / Autrice : Seunghwan Lee
• Direction : Aurélien Gourrier, Kwangseuk Kyhm
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Physique pour les Sciences du Vivant
• Date : Inscription en doctorat le 01/09/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes en cotutelle avec Pusan National University
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale physique
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Interdisciplinaire de Physique
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : OPTIMA: Optique et Imageries

Mots clés

Mots clés libres

Tubule dentinaire

Visualisation 3D

Microscopie à deux photons

Tissus minéralisés

Dentine

Microscopie de fluorescence

Dentinal tubule

3d visualisation

Two photon microscopy

Sample preperation

Image qualtiy anaylsis

Dentinogenesis imperfecta

Résumé

La théorie largement acceptée pour expliquer la mécanosynthèse dans les dents humaines est la théorie hydrodynamique. Selon cette théorie, les tubules dentinaires sont remplis de liquide dentinaire, et l'écoulement de ce liquide est influencé par les fluctuations de température externe, ainsi que par des stimuli chimiques ou physiques. Le mouvement du fluide dentinaire déclenche des réponses dans les odontoblastes, les nerfs et le complexe odontoblaste-nerf. La configuration précise du tubule contenant le fluide est un facteur crucial dans l'étude de la mécanosensibilité. Cependant, la quantification de la mécanosensibilité dans les dents humaines est un défi. Par conséquent, les recherches actuelles s'appuient sur des simulations. Néanmoins, ces études de simulation utilisent un modèle simplifié du tubule dentinaire, qui ne correspond pas à la structure complexe de la dentine, cela est dû à la dépendance de la microscopie électronique à balayage qui manque d'informations tridimensionnelles détaillées. L'objectif principal de ma recherche doctorale est de générer des représentations visuelles tridimensionnelles de la dentine humaine au niveau de l'organe, afin d'améliorer de manière significative la fidélité des simulations de mécanosensibilité aux vraies dents humaines. Afin de parvenir à une visualisation en 3D des tubules dentinaires dans la dentine humaine, nous avons mené une étude visant à améliorer la profondeur de l'imagerie dans les mesures tridimensionnelles. Les résultats obtenus dans le cadre de notre projet de deuxième année démontrent que l'application du polissage des échantillons de surface, l'utilisation de milieux de coloration ayant un indice de réfraction adapté et la mise en œuvre de la microscopie à deux photons entraînent une augmentation significative de la profondeur d'imagerie. Grâce à cette méthode, nous avons pu acquérir des images à une profondeur de 100 µm, soit une amélioration de cinq fois par rapport à la profondeur maximale de 20 µm qui pouvait être atteinte avec le protocole conventionnel. Notre prochain objectif est d'appliquer nos découvertes à un sujet d'actualité dans la communauté de la recherche dentaire. Des études antérieures ont suggéré que les tubules dentinaires des dents humaines se bouchent progressivement avec l'âge. Nous avons mené une première étude afin d'explorer la manière dont cette obstruction des tubules varie en fonction de la localisation et de l'âge. Nos observations ont révélé une prévalence plus élevée de tubules dentinaires bloqués, principalement obstrués par la dentine péritubulaire, dans les dents âgées (55 ans) par rapport aux dents plus jeunes (11 et 28 ans). Nous avons utilisé l'imagerie optimisée par mciroscopie à deux photons ainsi que l'imagerie par autofluorescence pour identifier les obstructions dans les tubes en 3D sans processus chimique supplémentaire. Nous avons également pu profiter de la vitesse de balayage rapide de la microscopie confocale pour obtenir des images 2D à l'échelle du millimètre de la dentine humaine. En outre, nous avons observé les tubules dentinaires dans les dents de patients atteints de la maladie génétique rare Dentinogenesis Imperfecta, découvrant des irrégularités dans la forme et la distribution de ces tubules. D'autres recherches menées en collaboration avec des biologistes et des experts en analyse d'images permettront d'améliorer la précision de l'analyse quantitative des images et d'accroître la fiabilité statistique des résultats grâce à l'acquisition d'un plus grand nombre d'échantillons. Cette thèse de doctorat sera réalisée en cotutelle entre le LIPHY de l'Université Grenoble Alpes et le dpt Cogno-mécatronique de l'Université nationale de Pusan (Corée).

The widely accepted theory explaining mechanosesning in human teeth is the hydrodynamic theory. According to this theory, dentinal tubules are filled with dentinal fluid, and the flow of this fluid is influenced by external temperature fluctuations, as well as chemical or physical stimuli. The movement of dentinal fluid triggers responses in the odontoblasts, nerves, and odontoblast-nerve complex. The precise configuration of the tubule containing the fluid is a crucial factor when investigating mechanosensing. However, quantifying mechanosensitivity in human teeth is challenging. Consequently, current research relies on simulations. Nonetheless, these simulation studies employ a simplified model of the dentinal tubule, which does not correspond to complex dentin structure, it is due to the dependency on scanning electron microscopy wihch absence of detailed three-dimensional information. The principal objective of my PhD research is to generate three-dimensional visual representations of human dentin at the organ level, significantly enhancing the fidelity of mechanosensitivity simulations to real human teeth. In order to achieve 3D visualisation of dentinal tubules in human dentin, We conducted a study aimed at enhancing the depth of imaging in three-dimensional measurements. The results obtained from our second-year project demonstrate that the application of surface sample polishing, the utilisation of staining media with a matched refractive index, and the implementation of two-photon microscopy, leads to a significant increase in imaging depth. With this method, we were able to acquire images at a depth of 100 µm, a fivefold improvement over the maximum depth of 20 µm that could be achieved using conventional protocol. Our next aim is to apply our discoveries to a subject of current interest in the dental research community. Previous investigations have suggested that the dentinal tubules in human teeth become progressively blocked with age. To explore how this tubule blockage varies concerning location and age, we conducted an initial study. Our observations revealed a higher prevalence of blocked dentinal tubules, primarily obstructed by peritubular dentin, in aged teeth (55 years) compared to younger teeth (11 and 28 years). We used optimised two-photon mciroscopy imaging as well as autofluorescence imaging to identify blockages in the tubes in 3D without additional chemical processes. We were also able to take advantage of the fast scanning speed of confocal microscopy to obtain millimetre-scale 2D images of human dentin. Furthermore, we observed the dentinal tubules in the teeth of patients affected by the rare genetic disorder Dentinogenesis Imperfecta, uncovering irregularities in both the shape and distribution of these tubules. Further collaborative research with biologists and image analysis experts will improve the accuracy of quantitative image analysis and increase the statistical reliability of results by acquiring more samples. This PhD thesis will be undertaken in cotutelle between the LIPHY of the University Grenoble Alpes and the Cogno-mechatronics dpt of Pusan National University (Korea).