LUE - Lésions chimiques de l'ARN dans les pathologies neurodégénératives

LUE - Chemical RNA damage in neurodegenerative-related pathologies

• Auteur / Autrice : Kasturi Raorane
• Direction : Iouri Motorine, Mark Helm
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la Vie et de la Santé - BioSE
• Date : Inscription en doctorat le 14/10/2020
• Etablissement(s) : Université de Lorraine
• Ecole(s) doctorale(s) : BioSE - Biologie Santé Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IMoPA - Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Equipe 1 : ARN, RNP, maturation-structure-fonction

Mots clés

Mots clés libres

Séquençage de l'ARN

Oxydation chimique de l'ARN

Ngs

8-oxoguanosine

Sites abasiques

Vieillissement et pathologie de la maladie d'alzheimer

RNA sequencing

Chemical RNA oxidation

Ngs

8-oxoguanosine

Abasic sites

Aging and alzheimer's disease pathology

Résumé

Les espèces réactives de l'oxygène jouent un rôle crucial dans divers processus physiologiques, allant de la défense immunitaire à la régulation des gènes. Cependant, des niveaux élevés de ROS dus à des facteurs endogènes ou exogènes peuvent également conduire à l'oxydation spontanée de biomolécules, y compris l'ARN. Ces dommages oxydatifs peuvent entraîner la modification des nucléobases, la guanine étant une cible majeure en raison de son faible potentiel d'oxydoréduction. Par conséquent, la 8-oxoguanosine (oxo8G) a été signalée comme étant la lésion la plus abondante dans l'ARN. Le potentiel redox de l'oxo8G étant encore plus faible que celui de la guanine, ces sites oxo8G sont prédisposés à former d'autres produits d'oxydation tels que des lésions d'hydantoïne ou des sites abasiques. Des preuves de plus en plus nombreuses de la présence d'ARN oxydé dans les pathologies humaines, à savoir les maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer, le vieillissement, les maladies cardiovasculaires et le cancer, suggèrent son rôle dans la progression de la maladie. Au niveau moléculaire, les bases oxydées de l'ARN peuvent provoquer des erreurs dans la traduction des protéines ou altérer la régulation posttranscriptionnelle de l'ARN. Malgré ces observations globales, les mécanismes sous-jacents qui relient l'ARN oxydé à la régulation des processus cellulaires et à la pathogenèse restent obscurs. L'état actuel de la technique ne permet pas de cartographier avec précision les dommages sur l'ARN au niveau d'un nucléotide, en particulier dans les ARN longs. Cette thèse de doctorat visait à développer une approche basée sur le séquençage pour cartographier les sites endommagés par l'oxydation dans l'ARN à une résolution d'un seul nucléotide. La chimie spécifique introduite dans l'approche AlkAniline-Seq permet de fragiliser l'oxo8G par un traitement alcalin et induit ensuite une rupture de brin par clivage avec l'aniline. En outre, l'adaptation d'un traitement chimique spécifique permet de différencier partiellement l'oxo8G de ses produits d'oxydation ultérieurs, y compris les sites abasiques. L'enrichissement positif des fragments clivés lors du traitement à l'aniline permet en outre de cartographier le site endommagé par l'oxydation à une résolution d'un seul nucléotide. Comme preuve de concept, nous avons d'abord validé notre méthode en utilisant un oligomère synthétique contenant de l'oxo8G et un site abasique à un endroit spécifique. L'application in vitro sur l'oligomère synthétique et l'IVT-tRNAAsp structuré traité avec HOCl a confirmé l'efficacité de la méthode. Une cartographie in vivo et in vitro des sites endommagés dans l'ARN de levure traité au HOCl a révélé des dommages oxydatifs qui se produisent différemment dans les cellules vivantes par rapport à l'oxydation in vitro d'ARN isolés ou de complexes ARN-protéines. Enfin, les profils RNA-seq des échantillons isolés à partir de modèles cellulaires humains de la maladie d'Alzheimer et de différents tissus de souris âgées ont révélé des schémas distincts dans les conditions pathologiques. Dans l'ensemble, ces résultats soulignent le potentiel de la méthode RNA-seq pour comprendre l'impact de l'oxydation de l'ARN en biologie.

Reactive oxygen species play crucial roles in diverse physiological processes, ranging from immune defense to gene regulation. However, elevated ROS levels due to endogenous or exogenous factors can also lead to spontaneous oxidation of biomolecules, including RNA. Such oxidative damage can result in the modification of nucleobases, with guanine being a major target due to its low redox potential. Consequently, 8-oxoguanosine (oxo8G) was reported to be the most abundant lesion in RNA. Since the redox potential oxo8G is even lower than the one for guanine, these oxo8G sites are predisposed to form further oxidation products such as hydantoin lesions or abasic sites. Growing evidence of oxidized RNA in human pathologies, namely neurodegenerative diseases like Alzheimer's disease (AD), ageing, cardiovascular disease and cancer suggests its role in disease progression. At the molecular level, the oxidized bases in RNA can cause errors in protein translation or alter RNA posttranscriptional regulation. However, the precise mechanisms by which oxidized RNA contributes to cellular regulation and pathogenesis remain unclear, largely due to the limitations of current methods in mapping RNA damage at nucleotide-level resolution, especially in long RNAs. This PhD thesis addresses this gap by employing a chemistry-based next-generation sequencing protocol called AlkAniline-Seq (AAS). The AAS chemistry involves alkaline treatment to fragilize oxo8G, followed by aniline-induced cleavage at oxidized guanosine sites. Furthermore, by adapting the initial chemical treatment, partial differentiation of oxo8G from its subsequent oxidation products, including abasic sites, is achieved. The positive enrichment of the fragments cleaved upon aniline treatment further enables mapping of the oxidatively damaged site at single nucleotide resolution. As a proof of concept, the method was first validated using synthetic oligomer containing oxo8G and abasic site at a specific location. In vitro application on synthetic oligomer and structured IVT-tRNAAsp treated with HOCl confirmed the method's effectiveness. An in vivo and in vitro mapping of damaged sites in HOCl-treated yeast RNA further revealed oxidative damages that proceed differently in living cells as compared to in vitro oxidation of isolated RNA or RNA-protein complexes. Finally, the RNA-seq profiles of the samples isolated from AD human cellular models and different aged mouse tissues revealed distinct patterns in pathological conditions. Overall, these findings highlight the potential of the RNA-seq method to provide insights into the impact of RNA oxidation in biology.