LUE : Méthode originale de criblage de peptides chélateurs de métaux pour leurs propriétés antioxydantes utilisant la Résonance Plasmonique de Surface

par Sarah El hajj

Projet de thèse en Procédés Biotechnologiques

Sous la direction de Laetitia Canabady rochelle et de Caroline Gaucher.

Thèses en préparation à l'Université de Lorraine , dans le cadre de SIMPPÉ - SCIENCES ET INGENIERIES DES MOLECULES, DES PRODUITS, DES PROCEDES ET DE L'ÉNERGIE , en partenariat avec LRGP - Laboratoire Réactions et Génie des Procédés (laboratoire) et de Axe 3 - BIOPROMO - Bioprocédés Biomolécules (equipe de recherche) depuis le 20-09-2018 .


  • Résumé

    Les antioxydants sont largement utilisés pour des applications en lien avec la santé, la cosmétique et la nutrition. Etant donné que certains antioxydants synthétiques sont suspectés d'être toxiques chez l'homme, la découverte de nouvelles biomolécules dotées de cette bioactivité est nécessaire. La capacité antioxydante d'une molécule est étroitement liée à sa capacité de piéger les radicaux libres et à inhiber la peroxydation lipidique. Selon leur séquence, certains peptides sont capables de chélater des ions ferreux Fe(II), inhibant ainsi l'oxydation du fer via la réaction de Fenton. Cette propriété de chélation est un mécanisme antioxydant indirect qui inhibe à son tour les réactions radicalaires en chaîne et retarde les phénomènes d'oxydation. A ce jour, la découverte de nouvelles molécules bioactives est généralement basée sur une approche empirique systématique, i.e., plusieurs cycles de fractionnement séparation suivis de tests biologiques jusqu'à l'identification des séquences peptidiques par spectrométrie de masse (MS/MS). Une telle approche souffre de plusieurs inconvénients: mise en œuvre fastidieuse, coût élevé, incertitude quant à l'obtention de peptides bioactifs ou faible concentration du peptide d'intérêt. Par conséquent, de nouvelles méthodes de criblage ayant une forte sensibilité devraient être considérées avant de se lancer dans une séparation longue et fastidieuse d'un mélange complexe de peptides. De plus, la capacité de chélation des peptides peut être affectée par le catabolisme in vivo (pH, digestion enzymatique, …) lors de l'administration chez l'homme, quelque soit la voie d'administration (per os or intraveineuse). Aussi, la modification de ces peptides en pseudopeptides les rendra plus stables, maximisant leur biodisponibilité (augmentation de la demi-vie et /ou franchissement des barrières physiologiques). Objectif général : Ce projet interdisciplinaire a pour objectif de découvrir et de tester de nouveaux peptides chélateurs de métaux pour leurs propriétés antioxydantes (CAPs) via le développement d'une méthode originale de criblage d'hydrolysats commerciaux. (i) Basée sur leurs capacités à chélater les ions ferreux Fe(II), le criblage des CAPs sera développé sur des d'hydrolysats commerciaux par Résonance Plasmonique de Surface (RPS) et validé dans un 2ème temps sur quelques hydrolysats produits en laboratoire. (ii) Ensuite, les séquences des CAPs seront identifiées par IMAC-MS (chromatographie d'affinité par ion métallique immobilisé lié à un détecteur MS), un couplage original actuellement en cours de développement dans le cadre d'une thèse hors-impact. (iii) Dans une seconde partie de cette thèse, les CAPs identifiés seront synthétisés chimiquement et modifiés en pseudopeptides afin d'éviter leur catabolisme in vivo et d'augmenter leur biodisponibilité pour de potentielles administrations in vivo. Finalement, la capacité antioxydante des peptides identifiés ou pseudopeptides sera validée sur un modèle cellulaire de stress oxydant (e.g. système immunitaire, système vasculaire). De plus, la découverte, au sein d'hydrolysats peptidiques, de nouveaux peptides chélateurs de métaux ayant des activités antioxydantes, produits à partir de protéines végétales (soja, tournesol), permettra la valorisation de co-produits locaux. Ce projet de thèse est divisé en 2 tâches principales. Tâche 1. Mettre au point une méthode innovante de criblage de peptides chélateurs de Fe(II) et identifier les peptides chélateurs de métaux à activité antioxydante (FR CNRS-UL 3209, LIBio, plateforme analytique de l'ENSAIA, SRSMC, LRGP). La méthode de criblage de peptides chélateurs de métaux présents dans des hydrolysats, développées précédemment sur du Ni(II) (Canabady-Rochelle et al, 2018), et initiée sur des hydrolysats commerciaux et sur des peptides synthétiques (Canabady-Rochelle et al, 2016 and 2017, 2018) sera dans un premier temps adaptée au Fe(II). Les méthodes développées sur le Fe(II) seront mises au point sur des hydrolysats commerciaux puis validées sur des hydrolysats produits en laboratoire (LRGP, URAFPA). Le criblage sera effectué à différents niveaux afin de (i) déterminer par RPS les meilleures conditions de biocatalyse pour produire les peptides chélateurs de métaux et les meilleurs hydrolysats en terme de propriétés chélatrices et (ii) d'identifier les meilleurs peptides chélateurs de métaux en utilisant une méthode originale couplant l'IMAC à la MS, actuellement en cours de développement (LRGP, LIBio). Tâche 2. Produire des peptides chélateurs de métaux par synthèse chimique et valider leur bioactivité. (LCPM, LRGP, CITHEFOR). Les séquences peptidiques criblées en tâche 1 seront produites par synthèse chimique afin d'obtenir des quantités suffisantes pour l'évaluation de leur bioactivité. En effet, la faible abondance des peptides d'intérêt au sein des hydrolysats produits, constitue un verrou expérimental pour l'évaluation de leur bioactivité in vitro. Dans un premier temps, l'activité antioxydante sera étudiée à l'aide de tests acellulaires (Canabady-Rochelle et al, 2015). Ensuite, la capacité antioxydante de ces peptides sera évaluée in vitro sur un modèle cellulaire (cellules musculaires lisses vasculaires) de stress oxydant (Belcastro et al., 2017). La variation des marqueurs du stress oxydant (Parent et al, 2015; Belcastro et al., 2017) sera comparée par rapport à l'hydrolysat total initial et des antioxydants de référence tels que l'acide ascorbique ou la N-acétylcystéine. Les peptides bioactifs les plus prometteurs seront modifiés chimiquement (pseudo-peptides) (Zhou et al, 2008; Moussodia et al, 2015) pour éviter leur catabolisme in vivo, à la fois dans le tractus gastro-intestinal et dans la circulation sanguine. De plus, leur résistance aux peptidases sera suivie au contact d'un modèle de barrière intestinale ou de sang total afin de déterminer leur biodisponibilité pour des applications in vivo ultérieures.

  • Titre traduit

    LUE : Innovative screening methodology for metal chelating peptides with antioxidant properties using Surface Plasmon Resonance (TA3 of impact project Biomolecules)


  • Résumé

    Antioxidants are widely used in health, cosmetic, and nutrition applications. As some synthetic antioxidants are suspected to be hazardous for human health, there is a need for new biomolecules presenting such bioactivities. The antioxidant capacity of molecules is closely linked to the scavenging of free radicals and the inhibition of lipid peroxidation. Peptides are interesting tools as some of them, depending on their composition, were shown to be able to chelate iron(II), inhibiting iron oxidation through Fenton reaction. This chelation power of peptides is an indirect physiological mechanism that in return inhibits radical chain reactions and delays oxidation phenomena. To date, the discovery of new bioactive molecules is generally based on systematic empirical approaches, i.e., several cycles of separation/fractionation followed by biological tests until identification of the peptide sequence by mass spectrometry (MS/MS). Such approaches suffer many drawbacks like fastidious, expensive, uncertainty to obtain bioactive peptides or low concentration of peptide of interest produced at small scale. Therefore new screening methods with high sensitivity should be considered before launching time-consuming separation of a complex mixture of peptides. Furthermore, chelation capacity of peptides may suffer from in vivo catabolism (pH, enzymatic digestion,…) when administrated to human whatever the administration route is (per os or intravenous). The modification of these peptides using pseudopeptide methodology will stabilize these peptides to maximize their bioavailability (increase half-life and/or absorption through physiological barriers). General objective: The present cross-disciplinary project aims at discovering and testing new potential chelating antioxidant peptides (CAPs) produced through proteolysis and evidenced through the setting up of original screening methods on commercial hydrolysates. (i) Based on their Fe(II) chelating ability, the CAPs screening method in hydrolysate will be developed using Surface Plasmon Resonance (SPR) and will be validated on some laboratory-produced hydrolysates. (ii) Then, CAPs sequences will be identified by IMAC-MS, an original coupling currently under development in the frame of another out-of impact PhD thesis. (iii) In a second part of this PhD, the identified CAPs will be chemically synthesised and modified to pseudopeptides in order to avoid in vivo peptide catabolism and to increase peptides bioavailability for potential in vivo application. Finally, the antioxidant capacity of identified peptides or pseudopeptides will be investigated on an in vitro model of oxidative stress based on cells representative for different majors systems (e.g. immune, vascular systems). Moreover, the discovery of new Fe(II) chelating peptides with antioxidant activity from various peptide hydrolysates, especially from soy and sunflower, will enable the valorisation of local by-products. This PhD project is divided in 2 main tasks. Task 1. Setting up of innovative screening methodologies of iron(II) chelating peptides and identification of the metal-chelating peptides for further studying their potential antioxidant activity (FR CNRS-UL 3209 platform, LIBio, ENSAIA analytical platform, SRSMC, LRGP). First, SPR screening methodology of metal chelating peptides in hydrolysates previously developed on Ni(II) (Canabady-Rochelle et al, 2018) will be adapted on Fe(II). This SPR methodology has been initiated on commercial hydrolysates and on synthetic peptides (Canabady-Rochelle et al, 2016 and 2017, 2018). The developed methodologies will be first set up on commercial hydrolysates and then validated on lab-produced hydrolysates (LRGP, URAFPA). Screening will be performed at various levels for: (i) determining by SPR the best biocatalysis conditions for producing metal-chelating peptides and the best hydrolysates in terms of metal chelation properties, and (ii) identifying the best chelating peptides using an original methodology coupling IMAC and MS currently under development (LRGP, LIBio). Task 2. Producing metal-chelating peptides by chemical synthesis and studying their bioactivity (LCPM, LRGP, CITHEFOR). The best metal-chelating peptides sequences screened from Task 1 will be produced by chemical synthesis to obtain sufficient amount for bioactivity evaluation. Indeed, profusion of peptides of interest might be too low in the produced hydrolysate, constituting an experimental bolt to perform in vitro bioactivity tests. First, the antioxidant activity will be investigated using acellular assays (Canabady-Rochelle et al, 2015). Then, antioxidant capacity of these peptides will be evaluated on an in vitro model of oxidative stress based on vascular smooth muscle cells (Belcastro et al., 2017). The variation of oxidative stress markers (Parent et al, 2015; Belcastro et al., 2017) will be compared to the initial whole hydrolysate and to reference antioxidants like ascorbic acid or N-acetylcysteine. As peptides may suffer from in vivo catabolism both in the gastrointestinal tract and in the blood stream, the most bioactive peptides will be chemically modified (pseudo-peptides) (Zhou et al, 2008; Moussodia et al, 2015) and their susceptibility to peptidases will be assessed in contact with an intestinal barrier model or with whole blood to determine their bioavailability for further in vivo applications.