Thèse en cours

Approche génomique des syndromes myélodysplasiques et myéloprolifératifs/myélodysplasiques

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Auteur / Autrice : Marion Divoux
Direction : Pierre FeugierJulien Broseus
Type : Projet de thèse
Discipline(s) : Sciences de la Vie et de la Santé - BioSE
Date : Inscription en doctorat le 15/01/2019
Etablissement(s) : Université de Lorraine
Ecole(s) doctorale(s) : BioSE - Biologie Santé Environnement
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : NGERE - Nutrition-Génétique et Exposition aux Risques Environnementaux

Résumé

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Partie 1 : étude génomique des MDS/MPN-RS-T triples-négatifs (JAK2, MPL, et CALR non-muté). Introduction Les syndromes frontières myélodysplasiques/myéloprolifératifs avec sidéroblastes en couronne et thrombocytose (MDS/MPN-RS-T) sont des hémopathies malignes rares, présentant un profil moléculaire spécifique qui associe des anomalies responsables d'une part du caractère myéloprolifératif (conduisant à un excès de cellules sanguines matures) et d'autre part du caractère myélodysplasique (conduisant à des anomalies morphologiques de la lignée myéloïde, à une apoptose intra-médullaire des précurseurs et in fine à des cytopénies sanguines). Le caractère myélodysplasique des MDS/MPN-RS-T peut être expliqué par des mutations de gènes codant pour des acteurs de l'épissage, comme SF3B1 (85-90%), SRSF2 (7%), U2AF35 (4%) et ZRSR2 (3%), et/ou des mutations de gènes codant pour des acteurs de la régulation épigénétique comme ASXL1 (15-29%), TET2 (10-25%), EZH2 (7%), DNMT3A (13-15%), SETBP1 (13%) et IDH2 (0-4%). Cependant, les déterminants moléculaires du versant myéloprolifératif des MDS/MPN-RS-T ne sont pas totalement élucidés. Le panorama mutationnel des syndromes myéloprolifératifs Philadelphie négatifs sont dominés par les mutations gain de fonction de l'exon 14 de JAK2 (Janus Kinase 2), les mutations faux-sens situées dans l'exon 10 de MPL (Myeloproliferative Leukemia) et les insertions/délétions avec décalage du cadre de lecture dans l'exon 9 de CALR (Calreticuline) qui mènent à l'activation autocrine du récepteur à la Thrombopoïétine. Dans le contexte des MDS/MPN-RS-T, les mutations de JAK2, MPL et CALR ne sont présentent respectivement que dans 42-57%, 1-3% et 0-1% des cas, ce qui signifie que près de 50% des MDS/MPN-RS-T ne sont pas porteuses d'une mutation connue pour être responsable du caractère prolifératif. Objectif Notre but est d'identifier la ou les mécanisme(s) moléculaire(s) responsable(s) du caractère myéloprolifératif des MDS/MPN-RS-T JAK2, MPL, et CALR non-mutés, pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de la prolifération de la lignée mégacaryocytaire. Avancée du projet Les exomes de 12 échantillons issus de 6 cas index de MDS/MPN-RS-T triple négatifs (tissu non-tumoral et tissu tumoral pour chaque cas) ont été séquencés. Cela a permis de confirmer l'absence de mutation de JAK2, MPL ou CALR mais aussi la présence de mutations de SF3B1, avec une charge allélique estimée comparable à celle évaluée dans le cadre du diagnostic. Nous avons identifié 49 gènes candidats porteurs de variants ponctuels ayant franchi tous les filtres de sélection. Les annotations fonctionnelles des gènes affectés montrent notamment un enrichissement pour les fonctions : « transduction du signal », « activité de transcription », « activité des canaux potassiques », « processing des ARN messager » et « liaison à l'ARN messager ». Ces variants ont été confirmés sur une cohorte de validation (collection biologique constituée) en partenariat avec le laboratoire MLL en Allemagne. Nous avons donc retenu 5 gènes candidats pertinents atteints par des variants ponctuels. Nous avons également retenu 1 gène candidat dupliqué dans 3 des 6 exomes. Des validations fonctionnelles sont en cours sur modèle cellulaire. Par ailleurs, nous avons également constitué une collection biologique afin de réaliser une analyse comparative du méthylome par RRBS. L'analyse du méthylome est en cours. Perspectives Poursuite des test fonctionnels et de l'analyse du méthylome. Partie 2 : Étude moléculaire des SMD avec excès de blastes traités par agents déméthylants. Introduction Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont les hémopathies malignes myéloïdes les plus fréquentes dans les pays industrialisés. Elles touchent essentiellement les sujets de plus de 65 ans. Il s'agit d'un ensemble hétérogène de pathologies clonales de la cellule souche hématopoïétique, caractérisées par l'accumulation d'anomalies cytogénétiques responsables d'une apoptose intra-médullaire, de cytopénies sanguines (anémies, neutropénies, thrombopénies), d'anomalies morphologiques des cellules de la lignée myéloïde et dans certains cas d'un excès de cellules blastiques sanguines et/ou médullaires. Les SMD avec excès de blastes font partie des SMD qui présentent un risque élevé d'évolution vers une leucémie aiguë myéloblastique secondaire dont le pronostic est très réservé. Sur le plan physiopathologique, les SMD relèvent d'anomalies épigénétiques, en particulier de la dérégulation de la méthylation des gènes, en lien avec des mutations de TET2 et DNMT3a. Les SMD présentent donc des anomalies du profil de méthylation. Il existe en effet une hypométhylation globale, associée à une hyperméthylation paradoxale des zones régulatrices de l'expression des gènes suppresseurs de tumeur, entrainant ainsi leur sous-expression. Les stratégies thérapeutiques actuelles reposent sur l'utilisation d'agents « hypométhylants », notamment la 5'-azacytidine (Azacytidine). Ces analogues de la cytosine sont incorporés dans l'ADN durant la phase S. Leur action hypométhylante passe par une inhibition des DNA Methyl Transferases (DNMT). L'Azacytidine possède une double action, hypo-méthylante (démontrée) et cytotoxique (plus discutée), qui permet de restaurer l'hématopoïèse et d'obtenir une réponse dans 50% des cas. L'évaluation de l'efficacité de l'Azacytidine repose sur les critères cliniques et biologiques de l'International Working Group (IWG) : (i) la réponse clinique (indépendance transfusionnelle, amélioration de l'état général) et (ii) la réponse biologique (normalisation de l'hémogramme, du myélogramme et du caryotype médullaire). L'amélioration de ces paramètres peut toutefois être longue à apparaître et il n'existe pas de marqueur précoce de réponse. Dans plus de 85% des cas, ces critères ne sont pas évaluables avant au moins 6 mois. Environ 50% des patients sont à terme considérés comme non-répondeurs, mais traités en amont pendant plusieurs mois, sans bénéfice final. En cas de progression de la maladie ou de non réponse avérée, le traitement est arrêté et la prise en charge devient palliative. L'évaluation précoce de la réponse au traitement est au cœur des préoccupations actuelles. Les « Differentially Methylated Regions » (DMR), sont des régions de l'ADN dont le niveau de méthylation peut varier selon les patients. L'analyse des niveaux de méthylation de ces DMR peut révéler des profils corrélés à la réponse au traitement. L'étude concomitante du transcriptome permet d'identifier les DMR pertinents, dont la réversion du niveau de méthylation est associée à la réexpression de gènes déterminants dans l'efficacité thérapeutique, à savoir la reprise d'une hématopoïèse normale. Objectifs - Comparer, entre répondeurs et non-répondeurs à l'Azacytidine, les Differentially Methylated Regions (DMR) dont le niveau de méthylation a changé entre le diagnostic et la fin du 3ème cycle mensuel de traitement afin d'identifier précocement des profils de méthylation prédictifs de la réponse à l'Azacytidine. - Identifier dès le diagnostic les profils des DMR prédictifs de la réponse à l'Azacytidine. - Identifier les gènes dont le niveau d'expression est corrélé à ces profils de méthylation des DMR Avancée du projet Le projet s'appuie sur l'étude prospective MYRAGE (Myélodysplasies de haut Risque, étude Génétique et Épigénétique ; N° ClinicalTrials.gov : NCT03217903), portée par le CHRU de Nancy et incluant le recrutement de malades atteints de SMD avec excès de blastes, traités par Azacytidine et suivis pendant 12 mois. Un prélèvement médullaire est réalisé au diagnostic et après 3 mois de traitement pour extraction des ADN et des ARN puis étude du méthylome et du transcriptome. À ce jour, 94 patients ont été pré-inclus dans l'étude MYRAGE. Les accords administratifs (CPP, ANSM) ont été obtenus, de même qu'un financement pour l'analyse du méthylome des échantillons sur puce INFINIUM® Methylation EPIC 850K (Illumina, San Diego, CA, États-Unis d'Amérique) sur la plateforme de l'unité Inserm U1256.