Le rôle de la Caséine Kinase 2 dans le cycle de vie du SARS-CoV-2 : implications pour le développement d'antiviraux ciblés sur l'hôte

Unraveling the role of casein kinase 2 in the SARS-CoV-2 lifecycle: Implications for host-targeted antiviral development

• Auteur / Autrice : Dennis Salomon Lopez molina
• Direction : Jean-Michel Pawlotsky
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 31/01/2025
• Etablissement(s) : Paris 12
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Créteil ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Mondor de Recherche Biomédicale (Créteil)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Equipe PAWLOTSKY - Virus, Hépatologie, Cancer
• Jury : Président / Présidente : Marie-Anne Rameix-welti
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Michel Pawlotsky, Nadia Rabah, Jean-Claude Manuguerra, Valerie Choumet, Hakim Ahmed-belkacem
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nadia Rabah, Jean-Claude Manuguerra

Mots clés

Mots clés libres

SARS-CoV-2

Inhibiteurs de Casein Kinase 2

Antiviraux de large spectre

Casein Kinase 2

SARS-CoV-2

Casin Kinase inhibitors

Broad-spectrum host-targeted antiviral agents

Casein Kinase

Résumé

Des études phospho-protéomiques globales ont mis en évidence la modification du paysage de phosphorylation de l'hôte par le SARS-CoV-2 et, notamment, l'activation de la caséine kinase II (CK2), un complexe protéique tétramérique composé de deux sous-unités alpha et de deux sous-unités bêta. En outre, les inhibiteurs de CK2 compétitifs à l'ATP existants ont réduit la réplication du SARS-CoV-2. Cependant, le site de liaison à l'ATP hautement conservé parmi les différentes protéines kinases limite la spécificité de la cible des inhibiteurs compétitifs à l'ATP. Par conséquent, le développement d'inhibiteurs spécifiques de la CK2 représente une approche prometteuse pour les agents antiviraux ciblant l'hôte. Des SiRNA ciblant les sous-unités CK2 ont été transfectés dans des cellules HEK-ACE2/TMPRSS2, puis infectées par le SARS-CoV-2. Après 24 heures, l'ARN viral intracellulaire et la production de nucléoprotéines ont été mesurés par RT-qPCR et immunofluorescence, respectivement. La libération extracellulaire de la nucléoprotéine a été quantifiée par ELISA et l'infectivité de la descendance virale a été évaluée. Des études de co-immunoprécipitation des sous-unités CK2 avec des protéines virales ont été réalisées à l'aide de billes magnétiques couplées à des anticorps. De nouveaux inhibiteurs sélectifs de la CK2, brevetés en juillet 2020, ont été développés et évalués par RT-qPCR et immunofluorescence pour leur activité antivirale contre les coronavirus : variantes du SARS-CoV-2, HCoV-229E et OC43. L'inhibition des sous-unités CK2 a considérablement réduit la production intracellulaire de l'ARN viral et de la nucléoprotéine du SARS-CoV-2. Elle a également induit une diminution de la libération extracellulaire de la nucléoprotéine et une réduction drastique de l'infectivité de la progéniture virale. Des expériences de co-immunoprécipitation ont montré que la CK2 interagit avec la nucléoprotéine du SARS-CoV-2. Le criblage de nouveaux inhibiteurs sélectifs de la CK2 a révélé quatre composés dont l'activité antivirale est équivalente à celle des inhibiteurs de la CK2 compétitifs par rapport à l'ATP. Des expériences sur le temps d'addition ont révélé une perte de plus de 50 % de l'effet du médicament entre 7 et 9 heures après l'infection, ce qui indique que les inhibiteurs de la CK2 bloquent une étape tardive du cycle de vie viral. Ces composés ont également induit une diminution dose-dépendante d'environ 3 logs de la production d'ARN viral pour d'autres coronavirus, ce qui suggère une exigence commune de la CK2 pour les coronavirus. Cette étude apporte de nouvelles informations sur le rôle de la CK2 dans la réplication des coronavirus, en soulignant l'importance des sous-unités de la CK2 dans la réplication du SARS-CoV-2. Nos résultats suggèrent une interaction entre CK2 et la nucléoprotéine, cruciale pour atteindre une étape tardive du cycle de vie du virus. Le ciblage de CK2 par de nouveaux inhibiteurs de kinases spécifiques inhibe la réplication de plusieurs coronavirus, ce qui constitue une approche prometteuse pour le développement de composés antiviraux ciblés sur l'hôte et dotés d'une efficacité à large spectre.

Global phospho-proteomics studies highlighted the modification of the host phosphorylation landscape by SARS-CoV-2 and, notably, the activation of the casein kinase II (CK2), a tetrameric protein complex consisting of two alpha subunits and two beta subunits. Moreover, existing ATPcompetitive CK2 inhibitors reduced SARS-CoV-2 replication. However, the highly conserved ATP-binding site among various protein kinases limits the target specificity of ATP-competitive inhibitors. Therefore, developing CK2-specific inhibitors represents a promising approach for host-targeted antiviral agents. SiRNA targeting CK2 subunits were transfected into HEK-ACE2/TMPRSS2 cells, followed by SARS-CoV-2 infection. After 24 hours, intracellular viral RNA and nucleoprotein production were measured by RT-qPCR and immunofluorescence, respectively. Extracellular release of the nucleoprotein was quantified using ELISA, and viral progeny infectivity was assessed. Coimmunoprecipitation studies of CK2 subunits with viral proteins were performed using antibody-coupled magnetic beads. New selective CK2 inhibitors, patented in July 2020, were developed and evaluated, using RT-qPCR and immunofluorescence, for antiviral activity against coronaviruses: SARS-CoV-2 variants, HCoV-229E, and OC43. Knockdown of CK2 subunits significantly reduced intracellular production of SARS-CoV-2 viral RNA and nucleoprotein. It also induced a decrease in extracellular release of the nucleoprotein and a drastic impairment of viral progeny infectivity. Co-immunoprecipitation experiments have shown that CK2 interacts with SARS-CoV-2 nucleoprotein. Screening new selective CK2 inhibitors revealed four compounds with antiviral activity equivalent to ATP-competitive CK2 inhibitors. Time-of-addition experiments suggested a loss of more than 50% of the drug's effect between 7- and 9-hours post-infection, indicating that CK2 inhibitors block a late step in the viral lifecycle. These compounds also induced a dose-dependent decrease of approximately 3-logs in viral RNA production for other coronaviruses, suggesting a common requirement of CK2 for coronaviruses. This study provides novel insights into the role of CK2 in coronavirus replication, emphasizing the significance of CK2 subunits in SARS-CoV-2 replication. Our results suggest an interaction between CK2 and the nucleoprotein, crucial for achieving a late step in the virus lifecycle. Targeting CK2 with new specific kinase inhibitors inhibits the replication of several coronaviruses, indicating a promising approach for developing host-targeted antiviral compounds with broad-spectrum efficacy.