Identification moléculaire, caractérisation fonctionnelle et analyse de la régulation transcriptionnelle de canaux potassiques de type Shaker chez Vitis vinifera et Arabidopsis thaliana

Molecular identification, functional characterization and transcriptional regulation analysis of the Shaker potassium channel in Vitis vinifera and Arabidopsis thaliana

• Auteur / Autrice : Mamy Andrianteranagna
• Direction : Isabelle Gaillard
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : BIP - Biologie Intégrative des Plantes
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 16/12/2013
• Etablissement(s) : Montpellier, SupAgro
• Ecole(s) doctorale(s) : Systèmes Intégrés en Biologie, Agronomie, Géosciences, Hydrosciences, Environnement (Montpellier ; École Doctorale ; 2009-2014)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : BPMP - Biochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alain Vavasseur, Thierry Simonneau, Isabelle Gaillard, Hervé Sentenac
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christian Mazars, Nathalie Leonhardt

Mots clés

Mots clés libres

Canaux potassiques de type Shaker

Régulation transcriptionnelle

Acide abscissique

Arabidopsis thaliana

Vitis vinifera

Acidité du raisin

Shaker potassium channels

Transcriptional regulation

Abscisic acid

Arabidopsis thaliana

Vitis vinifera

Grape acidity

Résumé

Les canaux potassiques de type Shaker dominent la conductance potassique à la membrane plasmique des cellules végétales et sont responsables des flux K+ majeurs (entrants et sortants) nécessaires à la croissance et au développement de la plante. Chez Arabidopsis thaliana et Vitis vinifera, 9 gènes codant pour 9 sous-unités Shaker ont été identifiés. Depuis l'identification du premier canal Shaker en 1992, de nombreuses données ont été obtenues chez la plante modèle A. thaliana concernant les propriétés fonctionnelles de ces canaux, leurs régulations post-traductionnelles ainsi que leurs rôles in planta. Néanmoins, et malgré le nombre croissant d'études disponibles en transcriptomique, peu d'analyses ont porté sur les mécanismes moléculaires sous-jacents impliqués dans la régulation de l'expression de ces canaux au niveau transcriptionnel. Dans la première partie du manuscrit, est présentée une étude portant sur la régulation transcriptionnelle de l'expression du gène SKOR (pour Stelar K+ outward rectifier) chez A. thaliana. Le canal SKOR, exprimé au niveau du péricycle racinaire est impliqué dans la sécretion du K+ dans le xylème. Des experimentations en PCR quantitative ont révélé que l'expression de SKOR est drastiquement inhibée lors d'un stress hydrique ou une exposition des plantes à l'acide abscissique (ABA). Une analyse du promoteur de SKOR par découpage successif a été réalisée et a révélé une zone de 236 bp impliquée dans cette régulation. Il est à noter que des éléments cis de type ABRE ou DRE/CRT spécifiques d'une réponse ABA ont été repérés dans cette zone. La deuxième partie de cette thèse a pour objectif une valorisation des connaissances acquises chez l'espèce modèle Arabidopsis par transfert à une espèce économiquement importante. Chez la vigne, l'accumulation de K+ dans la baie de raisin entraîne une diminution de l'acidité du raisin et du moût conduisant à l'obtention de vins médiocres et de faible qualité organoleptique. Dans le but de comprendre les mécanismes sous-jacent à l'importation du K+ dans la baie de raisin et à son accumulation, les déterminants moléculaires impliqués dans le transport du K+ chez la vigne ont été recherchés. Deux canaux potassiques de type Shaker ont été clonés et caractérisés sur le plan fonctionnel. Le canal VvK1.2 qui est spécifiquement localisé dans la membrane plasmique des cellules de la pulpe, est soudainement et très fortement induit au moment de la véraison (début de la phase de maturation). Son expression dans ces cellules est, de plus, fortement augmentée lors d'un stress hydrique modéré. VvK1.2 est un canal à rectification entrante activé par des complexes CIPK(CBL-interacting protein kinase)/CBL (calcineurinB-like calcium sensor). Ce canal joue vraisemblablement un rôle dans la charge en K+ de la pulpe en relation avec l'acidité du fruit. Le second canal, nommé VvK3.1, est exprimé principalement dans le phloème de tous les tissus de la plante. VvK3.1 est un canal Shaker faiblement rectifiant impliqué dans le transport du K+ à longue distance via le phloème et donc dans l'importation du K+ dans la baie après la véraison. Par ailleurs, une forte expression de VvK3.1 a été détectée au niveau du pulvinus de vigne, structure non encore identifiée auparavant chez cette espèce. Ainsi VvK3.1 serait impliqué dans les mécanismes régulant le mouvement des feuilles chez cette espèce.

The Shaker family (nine members in grapevine (Vitis Vinifera) and in Arabidopsis thaliana) encodes voltage-gated K+ channels that dominate the membrane K+ conductance and provide major pathways for wholesale K+ uptake or secretion in most tissues and cell types. In Arabidopsis thaliana, a significant amount of information has been obtained for Shaker channel functional properties, post-translational regulations and roles in planta since the identification of the first K+ Shaker channel in 1992. In contrast, no significant attempt was made to unravel the molecular mechanism involved their regulation at the transcriptional level. In the first part of this manuscript, an analysis of the regulation of the Arabidopsis SKOR (Stelar K+ outward rectifier) Shaker gene at the transcriptional level is reported. Real time RT-qPCR analysis reveals that SKOR, which is expressed in the root pericycle and involved in the K+ release into the xylem sap, is drastically down regulated upon water stress and ABA exposure. SKOR promoter deletion study was performed and a zone of 236 bp involved in this regulation was identified. ABRE and DRE/CRT cis specific elements involved in the ABA response are present in this zone. The second part of this thesis is aimed at valorizing information gained from the model plant Arabidopsis thaliana by transfer towards an economically important plant namely grapevine. In grapevine, K+ accumulation in grape berries results in decreased must acidity, leading to wines with low organoleptic properties. In order to identify how K+ is taken up and accumulated during berry development and upon abiotic (drought and heat) stress, molecular determinants of K+ transport in grapevine are looked for. Here two K+ Shaker subunits have been cloned and characterized at the functional level. VvK1.2 is specifically expressed in the berry, where it displays a very strong induction at veraison (the inception of ripening) in flesh cells. Its expression in these cells is further strongly increased upon mild drought stress. VvK1.2 acts as a voltage gated inwardly rectifying K+ channel when co-expressed with its specific CBL-interacting protein kinase (CIPK)/calcineurinB-like calcium sensor (CBL) pairs. This channel is likely to play a major role in K+ transport in flesh cells of the developing berry in relation with grape acidity. The second channel, named VvK3.1 is mainly expressed in the phloem tissues throughout the plant in both source and sink organs. VvK3.1 is a weakly inwardly rectifying K+ channel, involved in long distance K+ transport via the phloem sap and in K+ loading of the berry after véraison. Moreover, high amounts of VvK3.1 transcripts have been detected in the grapevine pulvinus, a structure not already described in this species. Indeed, VvK3.1 may thus be involved in leaf movements in grapevine.