Développement de formulations lipidiques polyvalentes pour la délivrance d'ARN messager : Incidence du ciblage du récepteur au mannose des cellules dendritiques et ingénierie des cellules Natural Killer

Development of versatile lipid formulations for messenger RNA delivery: Impact of targeting the mannose receptor on dendritic cells and engineering of Natural Killer cells

• Auteur / Autrice : Christophe Delehedde
• Direction : Chantal Pichon
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 06/11/2023
• Etablissement(s) : Orléans
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Chantal Pichon, Bernard Verrier, Jeanne Leblond chain, Dieudonnée Togbe, Luc Even, Nathalie Rameix
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Bernard Verrier, Jeanne Leblond chain

Mots clés

Mots clés libres

ARNm

Lipopolyplexes

Lnp

Ciblage

Récepteur mannose

Routage intracellulaire

MRNA

Lipopolyplex

Lnp

Targeting

Mannose receptor

Intracellular routing

Résumé

Depuis la mise sur le marché des vaccins à ARNm pour le COVID-19, les formulations d'ARNm ont suscité beaucoup d'intérêt. Même si elles ont fait la preuve de leur efficacité vaccinale, d'autres enjeux doivent être relevés, notamment leur sélectivité. Cela concerne le développement de systèmes de délivrance spécifique afin de diriger l'ARNm vers des organes et des cellules d'intérêt. Un hybride polymère/lipide complexant l'ARNm (LPR, lipopolyplexe) a été décrit par notre équipe comme étant efficace pour la délivrance de l'ARNm. Le premier objectif de ma thèse a été d'étudier l'impact de la charge nette et de la présence d'un ligand trimannosylé d'une formulation de LPR, sur la capture et l'efficacité de transfection des cellules dendritiques. Les résultats montrent que la quantité de ligand portée par la formulation peut avoir un impact négatif sur l'efficacité de transfection tout en augmentant l'internalisation. Un routage rapide vers les compartiments acides induit une forte activation des senseurs moléculaires PKR et de NF-B. De manière intéressante, cet effet peut être contrecarré par l'utilisation d'un ARNm portant des nucléosides modifiés et présentant une coiffe de type cap 1 induisant une activation accrue de la protéine mTOR. Aujourd'hui, les thérapies à base d'ARNm ont un potentiel considérable en immunothérapie. Le deuxième objectif de la thèse a été de développer différents types de nanoparticules lipidiques (LNP et lipoplexes) pour délivrer efficacement l'ARNm dans des cellules Natural Killer (NK) très difficiles à transfecter. Ces formulations ont permis une transfection élevée (80%) tout en préservant la viabilité cellulaire. Elles ont permis une délivrance efficace d'un ARNm codant pour la protéine interleukine 2 (IL-2) dans des lignées cellulaires humaines NK (NK-92 et Khyg-1) et primaires humaines. Une amélioration de la prolifération des cellules NK in vitro a été mesurée par rapport à l'utilisation de protéine recombinante IL-2. En outre, aucun impact négatif sur les biomarqueurs d'activation et leurs capacités cytotoxiques a été observé. Ces résultats ouvrent la voie à l'utilisation de nanoparticules lipidiques et d'ARNm pour les stratégies thérapeutiques utilisant les cellules NK. De manière intéressante, ces formulations sont également très efficaces pour transfecter différents types de cellules immunitaires (cellules dendritiques, macrophages, lymphocytes B et T). De plus, elles sont également efficaces chez la souris après avoir été administrées par différentes voies. Pour conclure, les résultats obtenus soulignent l'importance du choix minutieux de tous les composants de la formulation pour obtenir une bonne internalisation et une traduction efficace de l'ARNm, en vue de son utilisation pour différentes thérapies.

The great success of messenger RNA (mRNA)-based vaccines against COVID-19 has really brought to light how interesting mRNA formulations could be. Since the introduction of mRNA vaccines for COVID-19, there has been considerable interest in mRNA formulations. Although they have proven their efficacy as vaccines, other challenges need to be addressed, in particular their selectivity. This concerns the development of specific delivery systems to target mRNA to organs and cells of interest. An hybrid polymer/lipid complexing mRNA (LPR, lipopolyplex) was described by our team as being effective for the delivery of mRNA. The first objective of my thesis project was to study the impact of the net charge and the presence of a trimannosylated ligand of an LPR formulation on the uptake and transfection efficiency of dendritic cells. The results show that the amount of ligand carried by the formulation can adversely affect transfection efficiency while increasing internalisation. Rapid routing to the acidic compartments induced strong activation of the PKR and NF-B molecular sensors. Interestingly, this effect can be counteracted by the use of mRNA carrying modified nucleosides and a cap 1 inducing increased activation of the mTOR protein. Today, mRNA-based therapies have considerable potential in immunotherapy. The second objective of the thesis was to develop different types of lipid nanoparticles (LNPs and lipoplexes) to efficiently deliver mRNA into Natural Killer (NK) cells that are very difficult to transfect. These formulations enabled high transfection (80%) while preserving cell viability. They efficiently delivered an mRNA encoding the interleukin 2 (IL-2) protein into human NK (NK-92 and Khyg-1) and primary human cell lines. An improvement in NK cell proliferation in vitro was measured compared to the use of recombinant IL-2 protein. In addition, there was no negative impact on activation biomarkers or cytotoxic capacity. These results pave the way for the use of lipid nanoparticles and mRNA for therapeutic strategies using NK cells. Interestingly, these formulations are also highly effective in transfecting different types of immune cells (dendritic cells, macrophages, B and T lymphocytes). What's more, they were also effective in mice when administered by different routes. In conclusion, the results obtained highlight the importance of carefully selecting all the components of the formulation to obtain an effective internalization and translation of the mRNA, leading to their application in a broad range of therapies.