CARACTERISATION STRUCTURE-FONCTION ET INGENIERIE D’ENZYMES IMPLIQUEES DANS LA DEGRADATION DE LA PAROI VEGETALE

Structure-function characterization and Enzyme Engineering for plant cell wall polysaccharide degradation

• Auteur / Autrice : Ahmed Khamassi
• Direction : Claire Dumon, Samuel Tranier
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 24/11/2023
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : CIMEs - Catalyse et ingénierie moléculaire enzymatiques
• Jury : Président / Présidente : Michael O'donohue
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Claire Dumon, Mirjam Czjzek, Stephanie Perret, Samuel Tranier, Marie Couturier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mirjam Czjzek, Stephanie Perret

Mots clés

Mots clés libres

Ingenierie d'enzyme

Polysaccharide Utilization Loci

Hemicellulases

Xylanase

Xylosidase

Synergie

Enzyme Engineering

Polysaccharide utilization loci

Hemicellulases

Xylanase

Xylosidase

Synergy

Résumé

La valorisation de la biomasse lignocellulosique est d'une importance primordiale pour le développement d’une bioéconomie circulaire. Ceci est dû au fait que les polysaccharides qui la composent, sont de loin les molécules organiques les plus abondantes trouvées dans la nature. Malgré sa complexité, son hétérogénéité, et sa rigidité, la paroi végétale est une source nutritive primaire et indispensable pour un très grand nombre d’êtres vivants. La saccharification est l’étape clé pour son utilisation, elle consiste à dégrader cette paroi en glucides fermentescibles. De nombreux microorganismes ont développé des stratégies et des enzymes pour dégrader la paroi végétale. Chez les Bacteroides, les gènes codant ces enzymes sont organisés en clusters génomiques appelés Polysaccharide Utilization Loci (PUL). Ces PULs orchestrent la déconstruction des polysaccharides grâce à la production contrôlée d’enzymes, travaillant en synergie afin d’en optimiser l’hydrolyse. En 2014, un PUL dédié à la dégradation de l'arabinoxylan a été découvert par l’équipe d’accueil dans le microbiote intestinal du termite Pseudocanthotermes militaris. Une xylanase et la xylosidase du PUL ont servi de modèle d’étude pour questionner la synergie enzymatique au niveau moléculaire. La thèse a porté dans un premier temps sur la caractérisation de deux enzymes du PUL, la xylosidase Pm21(GH43) et la xylanase Pm12(GH10). Concernant la xylosidase, les analyses biochimiques ont montré l'importance des ions divalents pour une activité enzymatique optimale, notamment les ions Mg2+. Cette caractéristique distingue Pm21(GH43) des autres enzymes homologues connues jusqu'à présent, où l'ion Ca2+ joue le rôle d’activateur. La structure cristallographique de Pm21(GH43) a révélé une architecture atypique du site de fixation des métaux, permettant la coordination de deux ions divalents simultanément. Nos résultats computationnels ont démontré l’importance des deux ions Mg2+ pour la structuration d’une forme productive du site catalytique de l’enzyme. D'autre part, la structure cristallographique de la xylanase Pm12(GH10) a été résolue et a permis la caractérisation des différents sous-sites de fixation du substrat, ainsi que la présence d'une boucle flexible près du site actif (boucle 7). Des expériences de dynamique moléculaire ont montré l’implication de cette boucle non-conservée dans les changements conformationnels du site actif de cette xylanase. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons cherché à identifier les déterminants moléculaires modifiant la synergie entre les GH10 et les GH43. Pour atteindre cet objectif, Pm12(GH10) et Pm21(GH43) ont été fusionnées et co-ingéniérées dans le but d’améliorer leur synergie pendant la déconstruction de la biomasse lignocellulosique. Un protocole d’évolution dirigée visant la co-ingénierie de ces deux enzymes a été développé et a permis d’identifier 78 variants sur les 24000 criblés. Les 78 clones sélectionnés ont ensuite été finement caractérisés à faible débit. Parmi eux, 6 mutants ont montré des activités catalytiques améliorées sur arabinoxylane du blé qui néanmoins ne résultaient pas d’une amélioration de la synergie. La caractérisation des mutations, majoritairement positionnées autour de la boucle 7, a révélé une augmentation des constantes catalytiques (kcat) qui peut être expliquée par des modulations de la dynamique de la boucle 7 et une restructuration du site actif. Bien que la co-ingenierie n’ait pas répondu à notre question initiale concernant la synergie, l'approche expérimentale et les étapes d’optimisation effectuées au cours de ces travaux ont permis une meilleure compréhension de la catalyse de chacune des enzymes. Par ailleurs, l'approche élaborée durant cette thèse pourrait être le point de départ pour d’autres stratégies de co-ingénierie enzymatiques. Dans l’ensemble, cette étude a permis une meilleure compréhension des relations structure-activité des glycosyl-hydrolases des familles GH10 et GH43.

Valorization of Lignocellulosic (LC) biomass is a major economic and environmental issue. This is due to its component polysaccharides that represent the most abundant organic molecules in nature. Even with its inherent complexity, heterogeneity, and rigid structure, the plant cell wall remains an essential nutrient source for many organisms. Conversion of lignocellulosic polysaccharides into fermentable sugars is a crucial step for its valorization. Most micro-organisms have evolved molecular systems and enzymes to break down plant biomass. In Bacteroides, genes encoding these enzymes are assembled into genomic clusters known as Polysaccharide Utilization Loci (PUL). These PULs coordinate the hydrolysis of plant polysaccharides using a set of enzymes, working in synergy, to enhance deconstruction. In 2014, our team identified a PUL dedicated to arabinoxylan degradation in the gut microbiota of the termite Pseudocanthotermes militaris. A xylanase and a xylosidase encoded by the PUL have been used as case study to question the synergy at the molecular level. During this work, we initially focused on the characterization of two PUL enzymes: xylosidase Pm21(GH43) and xylanase Pm12(GH10). Regarding xylosidase Pm21(GH43), biochemical analysis revealed the importance of divalent ions for an optimal enzymatic activity. While most enzymes of the GH43 family typically need Ca2+, Pm21(GH43) specifically requires Mg2+ ions for its activity. The crystal structure of Pm21(GH43) revealed an unusual metal binding site architecture that allows the coordination of two Mg2+ ions simultaneously. Our computational studies underscored the importance of these two Mg2+ ions for structuring a productive form of the catalytic site of Pm21 (GH43). The xylanase Pm12 (GH10) was also characterized by biophysical approaches. Its crystallographic structure allowed the characterization of the substrate-binding site, as well as the identification of a flexible loop near the active site (loop 7). Molecular dynamics experiments indicated the crucial role of loop 7 in the conformational changes of the enzyme's active site. The second part of the project delved into the molecular determinants governing the synergy between GH10 and GH43. To meet our objective, Pm12(GH10) and Pm21(GH43) were fused and co-engineered to optimize their combined activity during the saccharification of wheat arabinoxylan polymers. A directed evolution approach was developed and optimized in order to establish an experimental protocol for the co-engineering of these two enzymes. Through this methodology, we screened an extensive library of 24000 enzyme variants. This screening process was concluded by the identification of 78 processing variants. A detailed low-throughput analysis of these variants led to uncover 6 mutants, with enhanced catalytic activities on wheat arabinoxylan. A fine-tuned characterization revealed that the enhanced activities were not a result of GH10-GH43 synergies but rather specific alterations in xylanase Pm12(GH10). All the Pm12(GH10) mutants displayed increased kcat constants which can be explained by changes in the dynamics of loop 7 and restructuration of the enzyme active site. Although the co-engineering strategy did not answer our initial question about the synergy between the xylosidase Pm21(GH43) and the xylanase Pm12(GH10), the co-engineering experimental approach and optimization steps undertaken enhanced our understanding of the catalysis of each enzyme. Moreover, the methodology developed in this thesis could serve as a starting point for future enzyme co-engineering strategies. Overall, these studies thus allow a better understanding of the structure-activity relationships of GH10 and GH43 enzymes.