Thèse soutenue

Etudes par résolution temporelle des protéines membranaires aux sources synchrotrons à rayons X de quatrième génération
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Auteur / Autrice : Sergei Bukhdruker
Direction : Gordon LeonardValentin Gordeliy
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
Date : Soutenance le 23/10/2023
Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : European synchrotron radiation facility (Grenoble, Isère, France ; 1988-....)
Jury : Président / Présidente : Marc Jamin
Examinateurs / Examinatrices : Thomas Gensch, Marat Yusupov
Rapporteurs / Rapporteuses : Svetlana Antonyuk, Josef Wachtveitl

Mots clés

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Résumé

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Les rhodopsines microbiennes (MR) utilisent un cofacteur rétinien pour effectuer diverses fonctions cellulaires et ils attirent beaucoup d'attention en raison de leur importance en écologie et de leur application potentielle en optogénétique.Dans les états fondamentaux des MR, le cofacteur est lié à un résidu lysine via une base de Schiff. L'absorption d'un photon entraîne l’isomérisation rétinienne. Le retour de ce fragment à son état initial s'accompagne de changements structurels, l'apparition d'intermédiaires dits photocycliques, qui produisent des fonctions differents, dans le cycle de MR. Pour comprendre les mécanismes moléculaires d’une MR il faut donc obtenir les structures de tous ces intermédiaires. De plus, comme la fonctionnalité des MR dépend fortement de petits changements structurels, les données structurelles doivent être de très haute résolution.Deux approches peuvent produire les structures des intermédiaires : le cryopiégeage et la cristallographie résolue en temps (TR-MX). Dans le cryopiégeage, les cristaux maintenus à une température contrôlée sont éclairés par la lumière et, une fois l'intermédiaire souhaité accumulé, sont refroidis instantanément à des températures cryogéniques. Des expériences standard de cristallographie aux rayons X suivent ensuite.En revanche, TR-MX résout les structures des intermédiaires à température ambiante. Les cristaux sont activés par la lumière et, après un certain délai, des données de diffraction sont collectées. Ce concept s'adapte particulièrement bien aux techniques de cristallographie en série, qui nécessitent la collecte de données partielles provenant d'un grand nombre de microcristaux orientés de manière aléatoire.Ce travail se concentre sur deux sous-familles de MR: les Protéorhodopsines (PR) et les Channelrhodopsines virales (VirChR).Les PR constituent une sous-famille abondante de MP qui, avec les centres de réaction photochimiques contenant de la chlorophylle, permettent aux organismes océaniques de maintenir un mode de vie phototrophique. Le pompage de protons par des PR vers le compartiment cytoplasmique d'une cellule crée un gradient de protons qui peut être utilisé par l'adénosine triphosphate (ATP) synthase pour créer une molécule d'ATP - l'une des principales molécules de stockage d'énergie dans les cellules vivantes, motivant une étude minutieuse de PR.La sous-famille de MR VirChR a une activité de canalisation dépendant de la lumière. La canalisation photosensible est particulièrement importante dans le domaine de l'optogénétique dans lequel le génie génétique est utilisé pour transfecter les canaux photosensibles dans les membranes des cellules neurales. L'éclairage des cellules transfectées dépolarise leurs membranes neurales, créant des signaux qui peuvent, par exemple, restaurer les fonctions cérébrales endommagées. Comprendre le mécanisme moléculaire de l’ouverture des canaux VirChR pourrait aider à concevoir des canaux plus efficaces et plus spécifiques.Cette thèse rapporte les structures cristallines des intermédiaires tardif de MAR, un PR issu d'actinobactéries marines, et d'OLPVR1, un VirChR issu de virus infectant les algues organiques des lacs. Sur cette base, des mécanismes de pompage de protons par les PR et de canalisation du sodium par les VirChR sont proposés. En particulier, il est démontré que les chaînes de liaisons hydrogène jouent un rôle clé dans la fonction et le mécanisme de ces deux MR très différents.Ce travail démontre également des méthodes alternatives pour résoudre les structures des intermédiaires MR, notamment la modification des contacts de compactage cristallin, la modification de l'acidité du milieu, l'exploitation des dommages causés par les radiations et l'utilisation de dérivatisation à haute pression avec des atomes de gaz rares. Le développement d'une sous-espèce de TR-MX qui permet de déterminer les structures des intermédiaires d'un petit nombre de cristaux est également signalé.