Spéciation du plutonium dans les milieux complexes

Plutonium speciation in complex media

• Auteur / Autrice : Loïc Daronnat
• Direction : Laurence Berthon, Catherine Berthomieu
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie Séparative, Matériaux et Procédés
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 05/12/2023
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences Chimiques (Montpellier ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : ICSM - Institut de Chimie Séparative de Marcoule
• Jury : Président / Présidente : Jean Aupiais
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laurence Berthon, Claire Le naour, Catherine Berthomieu, Mohamed Merroun, Muriel Amblard, Beccia Maria-rosa, Sandrine Sauge-merle
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Claire Le naour, Mohamed Merroun

Mots clés

Mots clés libres

Plutonium

Structure

Speciation

Proteine

Calmoduline

Complexation

Résumé

Le plutonium est un actinide d’intérêt majeur en raison de ses fortes chimio- et radio-toxicités, de sa dissémination dans le passé lors des essais nucléaires et du risque de pollution ou contamination lié à des rejets accidentels. Bien que des organes cibles aient été identifiés chez l’homme, les mécanismes de transport et d’accumulation du plutonium restent très mal connus. Ces travaux de thèse ont pour objectif d’étudier les mécanismes d’interactions entre le plutonium et des protéines cibles par une approche moléculaire. Cette étude détaille les propriétés d’interaction entre le Pu et le motif de liaison du calcium le plus couramment retrouvé dans les protéines, le motif EF-hand, ici issu de la calmoduline. Elle prend en compte l’influence de la spéciation du Pu et du pH sur l’interaction protéines – Pu et a demandé une mise au point des conditions de ces interactions à des pH physiologiques. Plusieurs variants du motif EF-hand avec des séquences d’acides aminés différentes ont été produits et leur comportement en présence de plutonium (III) et (IV) a été étudié par une approche multi techniques : spectrophotométrie UV-visible, spectroscopies XANES et EXAFS, spectrométrie de masse à ionisation electrospray, électrophorèse capillaire couplée à un spectromètre de masse à plasma inductif. Pour des concentrations de Pu et de protéines de l’ordre du micromolaire, des complexes de stœchiométrie Pu : Calmoduline 1 : 1 ont été observés, qui présentent une forte affinité pour le plutonium (IV), avec des constantes de stabilité log (K) ≈ 23,2 à 24,5 (ou des constantes de dissociation (Kd) de l’ordre de Kd ≈ 10-24 à 10-25 mol.L-1). L’affinité des complexes varie linéairement avec la charge de la boucle de complexation. Pour des concentrations plus élevées en plutonium (supérieures à 100 µmol.L-1) plusieurs comportements ont été observés : la formation de complexes 1 : 1 Pu(IV) : CaM, la formation de complexes 1 : 1 Pu(III) : CaM et la formation de clusters hexanucléaires de Pu(IV). Ces trois espèces sont liées entre elles par des équilibres qui dépendent de la nature des acides aminés présents dans la boucle de complexation tels que le nombre de fonctions acide carboxylique, qui pourrait être responsable de la réduction de Pu(IV) en Pu(III), l’hydrophobicité de certains acides aminés qui, en limitant l’accès des molécules d’eau au plutonium, réduirait la formation de clusters hexanucléaires de Pu(IV). Un variant sélectif des lanthanides (CaMLBT) a également été étudié pour complexer le plutonium (III), et cette étude a été étendue à l’américium (III). Pour ces deux actinides, un complexe de stœchiométrie An : CaMLBT 1 :1 est formé et des constantes de stabilité très élevées ont été observées: log(KPu(III)CaMLBT) = 14,4 ± 0,06 et log(KAm(III)CaMLBT) = 13,9 ± 0,3 (ou KdAm-CaMLBT de 14,1 fmol.L-1 et KdPu(III)-CaMLBT de 4,47 fmol.L-1). Ces constantes sont très élevées pour un site protéique. La constante mesurée pour l’interaction CaMLBT-Am(III) est la plus forte déterminée à ce jour pour une interaction protéine-Am(III).

Plutonium is an actinide of major interest due to its high chemo- and radio-toxicities, past dissemination during nuclear tests and the risk of pollution or contamination from accidental releases. While target organs have been identified in humans, the transport and accumulation mechanisms of plutonium remain poorly understood. The objective of this work is the investigation of the mechanisms of interaction between plutonium and target proteins using a molecular approach. This study details the interaction properties between Pu and the most commonly found calcium-binding motif in proteins, the EF-hand motif, here derived from calmodulin. It takes into account the influence of Pu speciation and pH on protein-Pu interactions and it required the optimization of experimental conditions to observed the interactions at physiological pH. Several variants of the EF-hand motif with different amino acid sequences were produced, and their behavior in the presence of plutonium (III) and (IV) were studied using a multi-technique approach: UV-visible spectrophotometry, XANES and EXAFS, electrospray ionization mass spectrometry, capillary electrophoresis coupled with inductive plasma mass spectrometry. At micromolar concentrations of Pu and proteins, Pu : Calmodulin complexes of 1 : 1 stoichiometry were observed, exhibiting a strong affinity for plutonium (IV), with stability constants log (K) ≈ 23.2 to 24.5 (or dissociation constants (Kd) on the order of Kd ≈ 10-24 to 10-25 mol.L-1). The affinity of the complexes varies linearly with the charge of the complexing loop. For higher plutonium concentrations (greater than 100 µmol.L-1), several behaviors were observed: formation of 1 : 1 Pu(IV) : CaM complexes, formation of 1 : 1 Pu(III) : CaM complexes, and formation of hexanuclear clusters of Pu(IV). These three species are linked through chemical equilibria depending on the nature of the amino acids present in the complexation loop. A higher number of carboxylic acid functions could be responsible for the reduction of Pu(IV) to Pu(III), and the hydrophobicity of some amino acids, by limiting water molecule access to plutonium, could reduce the formation of hexanuclear clusters of Pu(IV). A variant selective for lanthanides (CaMLBT) was also studied for complexing plutonium (III), and this study was extended to americium (III). For both actinides, a 1:1 An : CaMLBT complex was formed, and very high stability constants were observed with log(KPu(III)CaMLBT) = 14.4 ± 0.06 and log(KAm(III)CaMLBT) = 13.9 ± 0.3 (or KdAm-CaMLBT of 14.1 fmol.L-1 and KdPu(III)-CaMLBT of 4.47 fmol.L-1). These constants are exceptionally high for a protein site. The constant measured for the CaMLBT-Am(III) interaction is the highest observed to date for a protein-Am(III) interaction.