Diversités génétique et phénotypique de Staphylococcus aureus au cours de la mucoviscidose

Genetic and phenotypic diversity of Staphylococcus aureus in cystic fibrosis

• Auteur / Autrice : Agathe Boudet
• Direction : Catherine Dunyach, Hélène Marchandin
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 15/04/2024
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : VBIC- Virulence Bactérienne et Infections Chroniques
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Bacterial virulence and infectious disease
• Jury : Président / Présidente : Jean-Philippe Lavigne
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Catherine Dunyach, Hélène Marchandin, Karen Moreau, Partice Francois, Geneviève Hery-arnaud
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Karen Moreau, Partice Francois

Mots clés

Mots clés libres

Staphylococcus aureus

Mucoviscidose

Infection chronique

Toxines

Biofilm

Staphylococcus aureus

Cystic fibrosis

Chronic infectious diseases

Toxins

Biofilm

Résumé

La mucoviscidose (CF) est une maladie génétique impliquant des défauts du canal ionique Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator et marquée par des infections respiratoires. Staphylococcus aureus est la bactérie la plus fréquemment identifiée et les souches multirésistantes ou SARM font l’objet de recommandations de traitement spécifiques chez ces patients. Cependant, leur éradication peut échouer et une colonisation chronique (CC) est observée chez certains patients. Au cours de la persistance, certaines caractéristiques bactériennes peuvent être modifiées; ces modifications, dites adaptatives, vont permettre aux bactéries de se maintenir dans le tractus respiratoire. Très étudiés pour les bacilles à Gram négatif, ces mécanismes d'adaptation restent jusqu’alors peu décrits pour S. aureus au cours de la CF. L’objectif de ce travail était d’étudier trois types de caractéristiques de souches de SARM, ainsi que leurs modifications adaptatives au cours de la persistance chez les patients CF: la capacité à former du biofilm, la résistance aux antibiotiques et la virulence. Dans une première étude, nous avons évalué la capacité de 63 souches de SARM issues de 35 patients CF à former du biofilm en l'absence ou en présence d’antibiotiques anti-SARM dont le ceftobiprole, la ceftaroline et le linézolide. Notre étude a utilisé des techniques standardisées jamais appliquées jusqu’alors aux souches de SARM CF, le Biofilm Ring Test® (BRT®), l’Antibiofilmogram®, et le BioFluxTM 200, ainsi que l’Artificial Sputum Medium mimant les expectorations de patients CF. Les résultats ont montré que 27% des souches isolées de 37% des patients étaient fortement adhérentes, que le ceftobiprole et la ceftaroline présentaient une activité antibiofilm, avec des concentrations minimales d’inhibition du biofilm (CMIb) basses, y compris pour des souches isolées après 3 à 9 ans de CC. Une fratrie colonisée chroniquement par SARM a fait l’objet de la seconde étude portant sur l’émergence de la résistance au linézolide. Nous avons analysé 171 souches isolées de 68 échantillons durant 9 ans. Ces souches ont été génotypées et appartenaient toutes au Sequence Type 5 (ST5) et pour un des patients, à deux spa-types (t045 et t002). Parallèlement, l’émergence de la résistance au linézolide (CMI : 8 à >256 mg/L) sous traitement a été mise en évidence au sein de souches t002 clonales chez les deux patients. Le séquençage des génomes complets (SGE) a montré que la résistance était liée à une substitution G2576T présente dans un nombre variable de copies du gène de l’ARN ribosomique 23S. Des colonisations complexes ont été observées avec le co-isolement à partir d’un même échantillon de souches sensibles et résistantes au linézolide. Dans la troisième partie du travail, nous avons étudié les modifications adaptatives pouvant affecter le gène tst codant la toxine du choc toxique staphylococcique (TSST-1) au cours de la CC par SARM de trois patients incluant la fratrie précédente. Une excision du gène tst mais aussi du gène codant l’entérotoxine D a été détectée dans les souches de la fratrie Celle-ci correspond à la perte d’un îlot de pathogénicité de 15,6 kpb et d’un plasmide de 27 kb et était corrélée à une diminution de la virulence vis-à-vis de Caenorhabditis elegans. Le troisième patient était co-colonisé par des souches d’origine clonale (ST5 etST4887) hébergeant toutes le gène tst. Pour deux des patients, une décroissance de l’expression du gène tst a été observée au cours du temps et était corrélée à la diminution de la virulence. Nos résultats suggèrent que l’atténuation de virulence fait partie des stratégies adaptives des SARM et que la toxine superantigénique TSST-1 pourrait être un des acteurs de cette adaptation. Les souches de SARM sont douées de diverses capacités d'adaptation au cours la colonisation chronique des voies respiratoires des patients CF, probablement impliquées dans leur capacité de persistance au long cours chez ces patients.

Cystic Fibrosis (CF) is an inherited disease involving defects in the ion chanel Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator and marked by respiratory infections. Staphylococcus aureus is the most frequently identified pathogen in CF, and eradication of the multidrug-resistant strains (MRSA) is recommended. However, despite specific therapeutic strategies, chronic colonization (CC) is observed in some patients. During persistence, bacterial characteristics can be modified and these adaptive modifications contribute to the establishment of CC of the respiratory tract. Studied for Gram-negative bacilli, the adaptive mechanisms that might be developed by S. aureus infecting/colonizing CF patients remain scarcely studied. The aim of this work was to explore three characteristics of CF MRSA and their adaptive evolution in patients chronically colonized, i.e., biofilm-forming capacity, antibiotic resistance and virulence. In a first study, we assessed the ability of 63 MRSA strains isolated from 35 CF patients to form a biofilm in the absence or presence of anti-MRSA antibiotics such as ceftobirprole, ceftaroline, and linezolid. Our study used standardized approaches not previously applied to CF MRSA strains: the Biofilm Ring Test® (BRT®), the Antibiofilmogram®, and the BioFluxTM 200 system. These were adapted for use with the Artificial Sputum Medium mimicking the CF lung environment. We showed that 27% of the strains isolated from 37% of the patients were strong early biofilm producers and that ceftobiprole and ceftaroline exhibited effective antibiofilm activity on these strains, with low minimum biofilm inhibitory concentrations (bMIC) even for strains isolated 3 to 9 years apart in patients with MRSA CC. Two of these CC patients were siblings and were included in the second part of this work, describing the emergence of resistance to linezolid. We analyzed 171 MRSA strains isolated from 68 samples over a 9-year period. These strains belonged to Sequence Type 5 (ST5), and for one of the two patients, to two spa-types (t045, t002). The emergence of linezolid resistance (MIC: 8 to >256 mg/L) under treatment was observed in both patients in clonally related t002 MRSA strain. Whole genome sequencing (WGS) showed that resistance was related to a G2576T substitution present in a variable number of copies of the 23S rRNA gene. WGS and single nucleotide polymorphisms (SNPs) analysis revealed a complex pattern of colonization by clonally related (18 to 131 SNPs) and highly diversified (co-isolation of susceptible and resistant strains in some samples) MRSA populations over 9 years of colonization in siblings. In the third part of this work, we explored adaptive modifications that might affect the tst gene encoding the toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) in strains isolated from three patients including the aformentioned siblings. Successive strains isolated in siblings showed excision of the tst gene, possibly associated with the loss of the gene encoding the enterotoxin D. These observations were associated with the loss of a pathogenicity island (PI) of 15.6 kbp and a 27kb-plasmid, respectivley. Loss of tst gene-harboring PI was correlated with reduced virulence in Caenorhabditis elegans model. The third patient was co-colonized by ST5 (0-95 SNPs) and ST4887 (40-153 SNPs) strains, all harboring the tst gene. In the two patients, with persistence of tst+-MRSA, a decrease in tst gene expression was observed and correlated with a virulence decrease in C. elegans. Our results suggested that virulence attenuation is part of the adaptive strategies implemented by MRSA strains to persist in the CF respirator tract and that the superantigenic toxin TSST-1 can be an important player of this adaptation. This work demonstrated that MRSA strains displayed diverse adaptive traits during chronic colonization of the respiratory tract of CF patients, that probably contributed to their long-term persistence capacity in these patients.