Eupatilin and agonists of prostaglandin receptors as therapeutic approaches for juvenile nephronophthisis : characterization of their effects on ciliogenesis and shared mechanisms of action

Eupatilin et agonistes des récepteurs des prostaglandines comme approches thérapeutiques de la néphronophtise juvénile : caractérisation de leurs effets sur la ciliogenèse et de leurs mécanismes d'action

• Auteur / Autrice : Alice Tata
• Direction : Alexandre Benmerah
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 11/12/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Laurence Legeai-Mallet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Morgan Gallazzini, Alessandra Boletta
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Christine Vesque, Alice Meunier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ciliopathies

Cycle cellulaire

Prostaglandines

Néphrologie pédiatrique

Mots clés libres

Néphronophtise

Rein

Ciliopathies

Cils primaires

Cycle cellulaire

Thérapeutique

Prostaglandines

Eupatilin

Nephronophthisis

Kidney

Ciliopathies

Primary cilia

Cell cycle

Therapeutics

Prostaglandins

Eupatilin

Résumé

La Néphronopthise (NPH) est une maladie rénale tubulo-interstitielle autosomique récessive causée par des variants bialléliques de gènes codant pour des protéines constitutives des différents compartiments du cil primaire, un centre de signalisation cellulaire clé qui s'assemble dans la plupart des cellules en quiescence. La NPH est donc classée parmi les ciliopathies rénales qui peuvent être isolées ou associées à des manifestations extra-rénales dans des formes syndromiques. La NPH est très hétérogène génétiquement avec plus de vingt-trois gènes identifiés (appelés NPHP), même si NPHP1 représente à peu près de 50 % des gènes responsables identifiés.La NPH conduit inévitablement à une insuffisance rénale terminale (IRT), représentant de 5 à 10 % des IRT chez les enfants. Elle peut cependant être classée en trois sous-types cliniques distincts en fonction de son âge d'apparition : infantile, juvénile et adolescent/adulte. La NPH juvénile est la forme la plus répandue, conduisant à l'IRT à 13 ans. Elle est principalement causée par des variantes bialléliques de NPHP1 et d'autres gènes, notamment NPHP5 et NPHP6, qui codent pour des composants de la zone de transition, un sous-domaine à la base des cils contrôlant la ciliogenèse (c'est-à-dire l'assemblage des cils) et la composition ciliaire. Malgré les progrès récents, les traitements pour la NPH sont encore limités aux thérapies palliatives et aux transplantations rénales. Il est donc impératif de rechercher de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour ces raisons, les criblages phénotypiques de bibliothèques de petites molécules déjà approuvées en clinique (repurposing) ont montré leur impact potentiel dans cette direction et ont conduit à l'identification de plusieurs molécules intéressantes capables de corriger à un certain degré les phénotypes ciliaires caractéristique de la NPH juvénile.Dans la présente étude, nous avons étudié l'intérêt potentiel des agonistes des récepteurs des prostaglandines (EP) initialement identifiés en laboratoire dans le contexte du gène NPHP1, ainsi que de ceux de l'Eupatilin et d'un inhibiteur de la signalisation RHO, précédemment identifiés dans le contexte de NPHP6 et NPHP8, respectivement. Nous avons également inclus d'autres molécules intéressantes issues de notre crible en fonction de leurs effets connus sur la ciliogenèse. Ces composés ont été testés sur des cellules épithéliales rénales (UREC) précédemment caractérisées provenant de patients NPHP1 ainsi que sur de nouvelles UREC générées à partir de deux patients NPHP5, qui présentent également des défauts ciliaires importants (ciliogenèse et composition ciliaire). Alors qu'aucun effet spécifique n'ait été observé avec les nouvelles molécules issues de notre crible, les agonistes des EPs et l'Eupatilin ont montré des effets positifs sur la ciliogenèse dans les contextes NPHP1 et NPHP5. Fait intéressant, une analyse transcriptomique dans les UREC NPHP1 a révélé que le traitement à l'Eupatilin agit principalement par une régulation négative de la progression du cycle cellulaire, avec un certain chevauchement avec les voies modulées par les agonistes des EPs. Par conséquent, nos résultats étendent nos observations initialement faites dans le contexte de NPHP1 et élargissent l'utilisation potentielle des agonistes des récepteurs des prostaglandines et de l'Eupatilin dans différents contextes NPHPs. Une autre partie de notre travail a été consacrée à la génération de modèles d' NPHP5 d'organoïdes rénaux et de poisson zèbre invalidés pour NPHP5 dans le but de les utiliser pour études transcriptomiques et/ou pour le test des molécules caractérisées dans les URECs. Ces objectifs n'ont pas pu être atteints principalement parce que les différentes approches basées sur la technique CRISPR n'ont pas permis d'obtenir des clones d'hiPSC avec des allèles nuls homozygotes pour NPHP5 et n'ont pas conduit à des phénotypes de ciliopathies chez les embryons de poisson zèbre.

Nephronopthisis (NPH) is an autosomal recessive tubulo-interstitial kidney disease caused by variants in genes encoding for constitutive proteins of the different compartments of the primary cilium, a key cellular signaling hub which assembles in most quiescent cells. NPH is therefore classified as a renal ciliopathy which can be isolated or associated with extra-renal manifestations in syndromic forms. NPH is highly genetically heterogeneous with more than 23 identified genes (called NPHPs), even if NPHP1 represents nearly 50% of the identified causative genes. NPH inevitably leads to end stage kidney disease (ESKD), accounting 5 to 10% of ESKD in children. It can be however classified in three distinct clinical subtypes based on its age of onset: infantile, juvenile and adolescent/adult. Juvenile NPH is the most prevalent form, leading to ESKD at 13 years. It is mainly caused by biallelic variants in NPHP1 and other genes, including NPHP5 and NPHP6, which encode components of the transition zone, a key subdomain at the base of cilia controlling ciliogenesis (i.e. cilium assembly) and ciliary composition. Despite recent advancements, treatments for NPH are still limited to palliative therapies and kidney transplants, so there is strong need to seek for novel therapeutic strategies. For these reasons phenotypic screenings of libraries of small molecules already approved in clinics for other purposes (repurposing) have shown their potential impact on this direction and led to the identification of several interesting molecules able to rescue at a certain grade the ciliary phenotypes associated with juvenile NPH. In the present study, we investigated the potential interest of agonists of the prostaglandin receptors (EPs) that were initially identified in the laboratory in the context of NPHP1, as well as those of Eupatilin and of an inhibitor of RHO signaling, previously identified in the context of NPHP6 and NPHP8, respectively. We also included additional interesting hits selected from our previous screen based on their known effects on ciliogenesis. Those compounds were tested on previously characterized urinary kidney epithelial cells (URECs) from NPHP1 patients as well as on newly URECs generated from two NPHP5 individuals, which also present strong ciliary defects (ciliogenesis and ciliary composition). While the additional hits selected from our screen failed to demonstrate any specific effect, both EP agonists and Eupatilin showed positive effects on ciliogenesis in both NPHP1 and NPHP5 contexts. Interestingly, an RNAseq analysis in NPHP1 URECs revealed that Eupatilin treatment acts mostly through downregulation of cell cycle progression with some overlap with the pathways modulated by EP agonists. Therefore, our results extend our observations initially made in the context of NPHP1 and broaden the potential use of agonists of the prostaglandin receptors and Eupatilin in various NPHP conditions. Another part of our work was dedicated to the generation of zebrafish and kidney organoid models for NPHP5 with the ultimate goal to use it for transcriptomic analysis and/or for drug testing. These goals could not be reached mainly because the different CRISPR-based approaches tested failed to generate hiPSCs clones with homozygous NPHP5 null alleles and did not lead to ciliopathy phenotypes in zebrafish embryos.