Fabrication et culture de feuillets hépatiques et de sphéroïdes en lévitation acoustique

Fabrication and culture of hepatic sheets and spheroids in acoustic levitation

• Auteur / Autrice : Lucile Rabiet
• Direction : Jean-Luc Aider, Jérôme Larghero
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du vivant appliquées, biotechnologie et ingénierie des biosystèmes moléculaires
• Date : Soutenance le 28/11/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physique et mécanique des milieux hétérogènes (Paris ; 1997-....)
• Jury : Président / Présidente : Mathieu Hautefeuille
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Eleonora De Martin
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Mathieu Hautefeuille, Anne Corlu

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sphéroïdes médicamenteux

Cellules hépatiques

Microfluidique

Lévitation acoustique

Mots clés libres

Acoustofluidique

Lévitation acoustique

Foie

Sphéroïde

Microfluidique

Système microphysiologique

Auto-organisation

Organe-sur-puce

Acoustofluidics

Acoustic levitation

Liver

Spheroid

Microfluidics

Microphysiological system

Self-Organization

Organ-On-Chip

Résumé

Le foie est le plus gros organe endocrinien du corps humain et assume de nombreuses fonctions vitales : la détoxification des toxines et des médicaments, la sécrétion de bile, ou encore la synthèse d'albumine. Il a une capacité de régénération unique. Cependant, dans le cas de dommages sévères ou répétés, il perd son potentiel de régénération et doit être remplacé. La seule solution thérapeutique qui existe de nos jours est la greffe de foie ; mais elle fait face à une augmentation du nombre de demandes et à une baisse du nombre de donneurs. Par conséquent, les approches d'ingénierie tissulaire sont une alternative prometteuse aux greffes hépatiques. Le foie est composé en majorité d'hépatocytes, qui représentent 80% de son volume, ainsi que d'autres types cellulaires parmi lesquels les cholangiocytes, les cellules endothéliales, les cellules stellaires, les cellules de Kupffer et le tissu conjonctif. Les hépatocytes matures sont des cellules polarisées qui interagissent avec d'autres hépatocytes sur leur pôle apical, et avec les cellules endothéliales sinusoïdales via leur membrane basale. Cette structure est très importante pour leur fonctionnalité. Quand des hépatocytes sont isolés du foie et amplifiés en culture in vitro 2D, ils perdent leur polarité, leur fonctionnalité et leur capacité à proliférer. Ces dernières années, de nombreuses équipes de recherche ont exploré de nouvelles techniques de culture en 3D pour améliorer la fonctionnalité hépatique in vitro (cultures en sandwich, sphéroïdes, organoïdes, impression 3D, etc.). Même si elles sont bénéfiques pour la viabilité et la fonctionnalité des hépatocytes, ces techniques 3D ont leurs limites, comme l'utilisation de matrices extracellulaires et d'hydrogels mal caractérisés, ou le manque de reproductibilité pour les sphéroïdes et les organoïdes. La lévitation acoustique a été préalablement utilisée par nos équipes pour la culture à court terme de cellules épithéliales et mésenchymales. Nous avions montré que cette technique permettait la formation rapide de feuillets cellulaires. Nous avons depuis développé un nouveau système acoustique permettant la culture cellulaire à long terme pendant plusieurs semaines. Nous avons évalué la viabilité, l'auto-organisation et la fonctionnalité des cellules et avons obtenu des résultats très encourageants pour la culture en 3D de cellules stromales mésenchymateuses, de cellules hépatiques, de cellules endothéliales et d'un modèle de coculture. Les comportements d'auto-organisation ont été étudiés grâce à l'analyse de la vue de côté du dispositif de lévitation acoustique. Pour explorer les mécanismes d'auto-organisation, les cellules ont été soumises à différentes amplitudes de la force de radiation acoustique, traitées avec un chélateur de calcium pour empêcher l'adhésion cellule-cellule ou avec un inhibiteur de ROCK pour perturber la réorganisation du cytosquelette d'actine. Après différentes durées de lévitation, les caractéristiques biologiques des cellules ont été établies par marquage LIVE/DEAD, cytométrie en flux, immunofluorescence, analyses transcriptomiques, évaluation de la capacité de métabolisme de médicaments, et dosages d'albumine et d'urée. La morphologie des cellules hépatiques a été étudiée par immunomarquage des transporteurs, ainsi que par microscopie électronique à balayage. La stabilité génétique après lévitation a été évaluée par puce à ADN et études de caryotypes. Nos résultats démontrent le potentiel de la lévitation acoustique comme système microphysiologique alternatif pour la culture 3D de divers types cellulaires, en monoculture ou en coculture. Nous avons montré la robustesse de cette approche grâce à des études mécanistiques, biologiques et fonctionnelles. Ces résultats ouvrent la voie à des applications futures en thérapie cellulaire, en mécanobiologie et en découverte de médicaments.

Liver is the largest endocrine organ in humans which undertakes many vital functions including detoxification of toxins and drugs, synthesis of blood proteins such as albumin and coagulation factors, secretion of bile, glucidic metabolism and storage. The liver is unique in its capacity of regeneration as it can grow back to its initial volume after a hepatectomy of up to 70 %. However, in cases of repeated, severe injury, the liver loses its regenerative potential and needs to be replaced. The only therapeutic alternative that exists today is liver transplantation which is limited by an increasing number of demands and a decreasing number of donors. Therefore, tissue engineering approaches could be a promising alternative to hepatic grafts. The liver is mainly composed of hepatocytes representing 80% of the hepatic volume, as well as other cell types including cholangiocytes, endothelial cells, stellate cells, Kupffer cells, and conjunctive tissue. In the liver, mature hepatocytes are highly polarized cells which interact with other hepatocytes on their apical side, and liver sinusoidal endothelial cells through their basal membrane. This structure is very important for their functionality. When hepatocytes are isolated from the liver and amplified in 2D culture in-vitro, they lose their polarity, their functionality and their capacity to proliferate. In recent years, many research teams have explored new 3D culture methods in order to improve hepatic cell functionality in-vitro. These techniques include sandwich cultures using hydrogels, spheroid and organoid formation, cell sheet technology, 3D printing, etc. Despite the proof of concept that 3D culture is beneficial for improving hepatocyte viability and functionality, these techniques have their limits such as the use of poorly defined extracellular matrix and hydrogels like Matrigel, or the lack of reproducibility in case of spheroid and organoid formation. Therefore, a new scaffold free, reproducible method which would allow rapid restoration of cell junctions and polarity could be beneficial for hepatocyte viability and functionality. Acoustic levitation has been previously used by our teams for short-term cultures of epithelial and mesenchymal cells. We showed that this technique allowed the formation of distinct cell sheets very rapidly. We developed a new acoustic system which allows long term cell culture during several weeks. We evaluated the viability, the self-organization and the functionality of the cells in our system, and obtained very encouraging results for 3D cell culture of mesenchymal stromal cells, hepatic cells, endothelial cells and a co-culture model of hepatic and endothelial cells. The self-organizational behaviors, from cell sheets to spheroids have been investigated thanks to a timelapse analysis of the side-view of the acoustic levitation device. To investigate the self-organizational mechanisms, cells have been subjected to different amplitudes of the acoustic radiation force, as well as treated with a calcium chelator to prevent cell-cell adhesion, or a ROCK-inhibitor to disrupt the reorganization of the actin cytoskeleton. The cells in acoustic levitation were characterized at different time points by LIVE/DEAD staining, flow cytometry, immunofluorescence, drug metabolism capacities and transcriptomic analyzes, as well as albumin and urea dosage. HepaRG morphology was evaluated by immunostaining of transporters, as well as scanning electron microscopy. Genetic stability after levitation was evaluated via CGH array and karyotype studies. Our results demonstrate the potential of acoustic levitation as an alternative 3D culture microphysiological system for various cell types, in monoculture or coculture. We showed the reliability of this approach through mechanistic, biological and functional studies. These results pave the way towards further application for cell therapy, mechanobiology and drug discovery.