Nouvelles approches spectrométrie de masse structurale pour l'analyse de complexes protéiques impliquées dans la virulence bactérienne

New structural mass spectrometry approaches for the analysis of bacterial protein complexes involved in virulence

• Auteur / Autrice : Lucienne Nouchikian
• Direction : Julia Chamot-Rooke
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 15/12/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Spectrométrie de Masse pour la Biologie
• Partenaire(s) de recherche : Partenaires de recherche : Institut Pasteur. Département de Biologie structurale et chimie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Sarah Cianférani-Sanglier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Rémi Fronzes, Richard Alexander Scheltema
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sarah Cianférani-Sanglier, Florian Stengel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Facteurs de virulence

Protéines membranaires

Spectrométrie de masse

Mots clés libres

Pontage covalent

Spectrométrie de masse

Pathogènes

Facteurs de virulence

Protéines membranaires

Complexes protéiques

Cross-Linking

Mass spectrometry

Pathogens

Virulence factors

Membrane proteins

Protein complexes

Résumé

De nombreux agents pathogènes utilisent des facteurs de virulence qui leur permettent d'infecter les cellules humaines et d'échapper à la réponse immunitaire. Chez les bactéries, ces facteurs de virulence sont souvent des complexes protéiques membranaires de grande taille, ce qui les rend difficiles à étudier par des techniques traditionnelles de biologie structurale. Dans ce contexte, l'objectif de cette thèse était de développer de nouvelles méthodes basées le pontage covalent couplé à la spectrométrie de masse pour étudier la structure et les interactions de ces grands assemblages dans leur environnement natif. Les approches développées reposent sur l'utilisation d'agents pontants trifonctionnels innovants et de spectromètres de masse Orbitrap. Nous avons focalisé nos travaux sur deux pathogènes humains : Neisseria meningitidis et Leptospira. Pour Neisseria, nous nous sommes intéressés à sa nanomachinerie de piliation, qui est un facteur de virulence majeur. Nos résultats mettent en lumière de nouveaux partenaires d'interaction pour la sous-unité PilQ, ancrée dans la membrane externe, qui n'avaient jamais été décrits jusqu'à présents. Pour Leptospira, nos approches ont permis d'élucider l'architecture protéique complète de l'endoflagelle de la bactérie, élément essentiel pour sa motilité et sa virulence. D'une manière générale, cette thèse met en évidence tout l'intérêt des approches structurales basées sur la spectrométrie de masse pour la caractérisation fine d'assemblages protéiques bactériens dans leur environnement natif. Ces études peuvent permettre de mieux comprendre les mécanismes de virulence bactérienne et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre les infections.

Pathogens rely on virulence factors which allow them to infect human cells, evade immune responses, and protect themselves from hostile environments. In bacteria, these virulence factors are typically large membrane protein assemblies with a complex interaction network. Their size and hydrophobic nature renders them extremely difficult to study with traditional structural biology techniques. This thesis focuses on the use of mass spectrometry (MS) based techniques, notably cross-linking (XL)-MS, to study the structure and interaction of these large assemblies in their native environments. Using novel bio-orthogonal enrichable trifunctional cross-linkers designed by our lab, we demonstrate the use of XL-MS in two human pathogens, Neisseria meningitidis and Leptospira to elucidate vital structural components of their virulence factors. For Neisseria, novel binding partners were captured for its outer membrane pore protein (pilQ) from the Type IV piliation machinery, used for host cell adhesion and invasion. These interactions were captured in the pore's highly dynamic N-terminal domains which have previously evaded characterization. In Leptospira, XL-MS was critical for elucidating previously uncharacterized proteins and deciphering the complete and complex architecture of the endoflagella of the bacteria, essential for the bacteria's motility and host invasion. Overall, this thesis highlights the use of MS-based structural approaches as a compelling and straightforward method for structural characterization of proteins and their complexes and highlights its application in large and dynamic systems. These results help further our understanding in bacterial virulence mechanisms and allow the identification of novel therapeutic targets to ultimately combat infections.