Exocytose vésiculaire : caractérisation théorique d'événements uniques dans les cellules neuronales et neuroendocrines

Vesicular exocytosis: theoretical characterization of single events in neuronal and neuroendocrine cells

• Auteur / Autrice : Reina Dannaoui
• Direction : Alexander Oleinick
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie Physique
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 11/04/2024
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Processus d'Activation Sélectif par Transfert d'Énergie Uni-électronique ou Radiatif
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Ecole normale supérieure
• Jury : Président / Présidente : Elisabeth Lojou
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alexander Oleinick, Sophie Griveau, Danny O'hare, Dodzi Zigah
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Danny O'hare, Dodzi Zigah

Mots clés

Mots clés libres

Exocytose

Pore de Fusion

Simulation

Modelisation

Exocytosis

Fusion Pore

Simulation

Modeling

Résumé

L’exocytose vésiculaire est cruciale pour la communication intercellulaire. Nous explorons des méthodes électrochimiques, et en particulier l’amperométrie monocellulaire, où une électrode est insérée dans une synapse/cellule vivante ou proche de la membrane cellulaire, entrainant l’oxydation immédiate des neurotransmetteurs libérés vers l’électrode. Les courants obtenus, caractérisant les événements exocytotiques individuels, permettent d’estimer le contenu vésiculaire et la dynamique de libération, éclairant certains processus du phénomène exocytotique complexe. Pour analyser les données expérimentales, nous nous appuyons sur une description théorique et une expérimentation minutieuse. Les pics amperométriques varient et se classent par leur forme : déclin mono ou bi-exponentiel, indiquant respectivement une libération de neurotransmetteurs par diffusion ou un processus incluant diffusion et répartition dans la matrice intravésiculaire. Nous avons conçu un modèle pour extraire les paramètres physicochimiques et la dynamique d’ouverture des vésicules à partir de pics bi-exponentiels. Cette méthode et les résultats ouvrent la voie à la déconvolution et l’analyse statistique de grands ensembles de données expérimentales. Concernant les molécules d’intérêt, certaines sont électroactives et directement détectables par oxydation sur l’électrode. D’autres, non électroactives, sont surveillables via des électrodes modifiées avec des enzymes pour les transformer en produits détectables. La compréhension de ces processus enzymatiques est vitale pour interpréter les données. Pour évaluer les paramètres cinétiques, on utilise souvent des méthodes traditionnelles comme le graphique de Lineweaver-Burk. Cependant, ces méthodes ne conviennent pas aux enzymes immobilisées où la diffusion limite l’apport de substrat. Nous proposons un modèle intégrant les contraintes diffusionnelles du substrat pour une relation précise entre le courant du capteur et la concentration en substrat. De plus, nous avons modélisé la libération de glutamate, molécule non électroactive, avec un nanocapteur enzymatique. Pour simuler ce processus, nous considérons la diffusion du glutamate hors de la vésicule et dans l’espace extracellulaire vers l’électrode, où il est détecté par oxydation. Le mécanisme de l’oxydase de glutamate est décrit par un mécanisme de ping-pong bisubstrat. Nous avons élaboré un modèle tridimensionnel considérant la diffusion du Glu à travers le pore de fusion vers le nanocapteur. Les résultats obtenus pour l’analyse des pics à décrue bi-exponentielle et pour l’équivalent formel de l’analyse de Lineweaver-Burk sont prêts pour l’analyse directe des données expérimentales.

Vesicular exocytosis is a vital intercellular communication mechanism and can be probed using different strategies but we focus on electrochemical methods particularly, on single cell amperometry where an electrode is placed inside a living synapse/cell or in close vicinity of the cell membrane, resulting in an immediate oxidation of the released neurotransmitter molecules that are diffused to the surface of the electrode. Obtained currents characterizing individual exocytotic events (spikes) allow to estimate the vesicle’s contents as well as the dynamics of the release and casts light to some processes underlying complex exocytotic phenomenon. To extract information from experimental data, we relied on theoretical description of the investigated phenomena as well as experiment under the scrutiny. In amperometric traces, not all spikes are alike and they can be classified according to their shapes. The two major categories of spikes: one or two-exponential decay profiles, each with distinct implications. One-exponential spikes denote diffusion-controlled neurotransmitters release, while two-exponential spikes reflect a more intricate process involving diffusion and repartition of neurotransmitters in intravesicular matrix. We proposed a relevant model for extraction of physicochemical parameters and vesicle opening dynamics from experimental spikes with two exponential decay. The developed procedure and obtained results opens the way for the deconvolution and statistical analysis of large experimental data sets of spikes with one and two exponential decays. In this work the molecules of interest were electroactive, can be detected directly through oxidation at the electrode surface. However, many neurotransmitters are not electroactive and release of those molecules can be still monitored electrochemically using modified electrodes with enzymes immobilized on their surfaces to convert non-electroactive molecules into detectable electroactive products or intermediates. Understanding and characterization of the enzymatic processes are crucial for interpretation of the experimental data. To evaluate kinetic parameters, traditional methods like Lineweaver-Burk plots, which transform non-linear enzymatic rates into linear plots, are often used. However, these traditional methods were developed for the case when enzyme is homogeneously distributed in the solution and they are not adequate for characterization of the immobilized enzymes when diffusion may significantly limit supply of the substrate. These methods cannot be applied when substrate interfacial concentrations is different from its bulk concentration. To resolve this, we proposed a model that incorporates substrate diffusional constraints allowing us to obtain accurate relationship between sensor current and bulk substrate concentration and representing a formal equivalent of Lineweaver-Burk analysis in the context of enzymatic electrodes. Another problem we considered is modeling the vesicular exocytotic release and amperometric monitoring of glutamate, not electroactive molecule where our collaborators developed enzymatic nanosensor for monitoring its release which we considered in this work. To model the process, we are considering diffusion of the Glu out of the vesicle and in the extracellular space towards the electrode, where it is detected as described above. Glutamate oxidase mechanism can be described by bisubstrate ping pong mechanism. We developed a three-dimensional model taking into account diffusion of Glu through the fusion pore, its diffusion in the artificial synaptic cleft towards nanosensor. The results obtained for analysis of spikes with two exponential decays as well as formal equivalent of Lineweaver-Burk analysis for enzymatic electrodes are ready for straightforward use for analysis of experimental data.