Mécanismes d'activation de VKORC1 mutée: de la modélisation et la simulation de dynamique moléculaire à une nouvelle stratégie de modulation de la fonction enzymatique

Activation mechanisms of mutated VKORC1: from molecular modelling and dynamics simulation to a new strategy for modulation of enzymatic function

• Auteur / Autrice : Maksim Stoliarchuk
• Direction : Luba Tchertanov
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Inscription en doctorat le 11/07/2019
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interfaces : matériaux, systèmes, usages (Palaiseau, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de mathématiques et de leurs applications (1990-2019 ; Cachan, Val-de-Marne)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : École normale supérieure Paris-Saclay (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 1912-....)

Mots clés

Mots clés libres

Modélisation des protéins

Simulation de dynamique moléculaire

Enzyme VKROC1 et ses complexes

États fonctionneles

Méthodes statistiques

Modulation d'activation

Protein modelling

Molecular dynamics simulation

Enzyme VKORC1 and it complexes

Functional states

Analysis by statistical methods

Modulation of activation

Résumé

Notre recherche sur les effets des mutations sur les cibles attire l’attention de partenaires industriels. Un nouveau projet de recherche sur l’impact des mutations des VKORs – cible des anticoagulantes orales antivitamines K (AVKs), utilisés chez l’homme pour la prévention de la survenue de phénomènes thrombo-emboliques [1-3], est lancée sous forme d’un contrat industriel (LIPHATECH/VetAgro de Lyon). Nous poursuivons trois axes de recherche – (i) étude du mécanisme de l’activation enzymatique, (ii) description de l’alternance de l’activation provoquée par les mutations et (iii) compréhension du rôle des mutations sur la résistance aux AVKs. VKORC1 est une enzyme membranaire du réticulum endoplasmique, responsable de la réduction de la vitamine K époxyde en vitamine K quinone, activant la synthèse des facteurs de coagulation [4,5]. En l’absence de données structurales, plusieurs modèles topologiques de VKORC1 (de 3 à 5 hélices transmembranaires), ont été proposés par différents groupes des chercheurs [6]. Ces modèles sont principalement basés sur les données biochimiques et biophysiques qui sont pour les VKORs fréquemment contradictoires. Par conséquent, la topologie de VKORC1 ainsi que l'implication des résidus de cystéine (strictement conservés chez toutes les VKORs) dans le mécanisme enzymatique de la protéine restent incertaines. Nous avons construit un modèle 3D de la VKORC1 humaine sauvage (hVKORC1WT) à l'échelle atomique [7]. Des multiples simulations de DM étendus (1µs) du modèle intégré sur la membrane, en considérant tous les résidus de Cys sous leur forme oxydée (SH), nous ont permis d'identifier les résidus de Cys les plus susceptibles de former des ponts disulfures [1 and références herein]. Nous avons décrit quatre conformations métastables de hVKORC1WT, mimant les états fonctionnels de la protéine. L’étude de la reconnaissance de la vitamine K en forme époxyde et en forme réduite par les conformations prédites de hVKORC1WT a mis en évidence la sélectivité réciproque de la cible et du ligand. Le rôle des conformations de hVKORC1WT ciblées par chaque forme de la vitamine K dans le mécanisme de réduction de la molécule a ainsi été caractérisé. Nous avons postulé le mécanisme enzymatique détaillé de hVKORC1WT et caractérisé les interactions entre la cible prédite - hVKORC1WT à l'état actif - et trois AVKs différents en termes d’énergie libre de liaison. Les valeurs de l'energie libre de liaison ont été corrélés avec les constantes d'inhibition mesurées in vivo, validant nos modèles, les prédictions théoriques et le protocole utilisé. Nous explorerons VKORC1 dans le contexte de mutants présentant une résistance élevée aux inhibiteurs utilisés pour contrôler la population de rats. Les principaux objectifs sont la description des mécanismes d'activation des mutants et la compréhension du mécanisme de résistance. Pour comprendre les mécanismes d’activation du VKOR, une étude d’interaction avec sa protéine partenaire (PP) et la description du transfert des protons de PP à VKOR (PP est la protéine disulfide isomérase (PDI)) sont absolument indispensables. Les livrables de cette étude seront (i) des éléments fondamentaux en biologie des enzymes et en biophysique (description à niveau atomistique des mécanismes d’activation par échange de proton), (ii) des détails cruciaux en vue de leur application dans le développement de nouvelles molécules efficaces contre l’activation anormale des enzymes résistantes (définition des cibles-sites − le site catalytique des mutants et le site d’interaction du VKOR avec le partenaire), et (iii) le protocole bioinformatique applicable pour l’étude des autre enzymes. La prédiction numérique sera comparée aux mesures empiriques, qui seront réalisées à VetAgroSup Lyon et à IMOPA CNRS, Université de Lorraine (les partenaires du projet ANR ROC). Références: [1] Weston BW, Monahan PE. Familial deficiency of vitamin K-dependent clotting factors. Haemophilia 2008 Nov;14(6):1209-13. [2] Teichert M, Visser LE, van Schaik RH, Hofman A, Uitterlinden AG, DeSmet PA, et al. Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 (VKORC1) polymorphism and aortic calcification: the Rotterdam Study. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2008 Apr;28(4):771-6. [3] Hodroge A, Matagrin B, Moreau C, Fourel I, Hammed A, Benoit E, et al. VKORC1 mutations detected in patients resistant to vitamin K antagonists are not all associated with a resistant VKOR activity. J Thromb Haemost 2012 Dec;10(12):2535-43. [4] Jin DY, Tie JK, Stafford DW. The conversion of vitamin K epoxide to vitamin K quinone and vitamin K quinone to vitamin K hydroquinone uses the same active site cysteines. Biochemistry 2007 Jun 19;46(24):7279-83. [5] Wallin R, Wajih N, Hutson SM. VKORC1: a warfarin-sensitive enzyme in vitamin K metabolism and biosynthesis of vitamin K-dependent blood coagulation factors. Vitam Horm 2008;78:227-46. [6] Tie JK, Stafford DW. Structural and functional insights into enzymes of the vitamin K cycle. J Thromb Haemost 2016 Feb;14(2):236-47. [7] Chatron N., Chalmond B., Trouvé A., Benoît E., Caruel H., Lattard V., Tchertanov L. (2017). Identification of the Functional States of Human Vitamin K Epoxide Reductase from Molecular Dynamics Simulations. RSC Advances, 7, 52071 – 52090.

Our research on the mutation-induced effects on targets attracts the attention of industrial partners. The research project on the mutations impact in VKORs, the target of oral anti-vitamin K (AVKs) anticoagulants, used in humans for the prevention of the occurrence of thromboembolic phenomena [1-3], was carried out as the industrial contract (ENS Cachan/LIPHATECH / VetAgro of Lyon) (2014-2017). In 2018, we designed another project on VKORC1 in the context of mutants having high resistance to inhibitors used to control the rat population. Our project ANR-2018 ROC, has been accepted for funding (2019-2022), and we are starting to address the questions asked. We focuse three areas of research - (i) study of the mechanism of enzymatic activation, (ii) description of the alternation of activation caused by mutations and (iii) understanding of the role of mutations on resistance to AVKs. VKORC1 is a membrane enzyme of the endoplasmic reticulum responsible for the reduction of vitamin K epoxide to vitamin K quinone, activating the synthesis of coagulation factors [4,5]. In the absence of structural data, several topological models of VKORC1 (from 3 to 5 transmembrane helices) have been proposed by different groups of researchers [6]. These models are mainly based on the biochemical and biophysical data that are for the frequently contradictory VKORs. Therefore, the topology of VKORC1 as well as the involvement of cysteine-residues (strictly conserved in all VKORs) in the enzymatic mechanism of the protein remain uncertain. We have constructed a 3D model of wild-type human VKORC1 (hVKORC1WT) at the atomic scale [7]. Multiple simulations of extended DM (1µs) of the model integrated on the membrane, considering all the Cys residues in their oxidized form (SH), allowed us to identify the Cys residues most likely to form disulfide bridges. We have described four metastable conformations of hVKORC1WT, mimicking the functional states of the protein. The study of vitamin K recognition in epoxide form and reduced form by the predicted conformations of hVKORC1WT demonstrated the reciprocal selectivity of the target and the ligand. The role of hVKORC1WT conformations targeted by each form of vitamin K in the mechanism of reduction of the molecule was thus characterized. We have postulated the detailed nzymatic mechanism of hVKORC1WT and characterized the interactions between the predicted target - hVKORC1WT in the active state - and three different AVKs in terms of free binding energy (ΔG). The G values were correlated with the inhibition constants measured in vivo, validating our models, the theoretical redictions and the protocol used [7]. In the ANR ROC project, we will explore VKORC1 in the context of mutants with high resistance to inhibitors used to control the rat population. The main objectives are the description of mutant activation mechanisms and the understanding of the mechanism of resistance. Another new topic of this project is a modeling of the molecular complex composed of VKORC1 and its functional protein partner (PP). The biologically significant deliverable of this study will be the definition of the target for use in the development of new molecules effective against resistant enzymes. The numerical prediction will be compared to the empirical measurements, which will be carried out at VetAgroSup Lyon. References: [1] Weston BW, Monahan PE. Familial deficiency of vitamin K-dependent clotting factors. Haemophilia 2008 Nov;14(6):1209-13. [2] Teichert M, Visser LE, van Schaik RH, Hofman A, Uitterlinden AG, DeSmet PA, et al. Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 (VKORC1) polymorphism and aortic calcification: the Rotterdam Study. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2008 Apr;28(4):771-6. [3] Hodroge A, Matagrin B, Moreau C, Fourel I, Hammed A, Benoit E, et al. VKORC1 mutations detected in patients resistant to vitamin K antagonists are not all associated with a resistant VKOR activity. J Thromb Haemost 2012 Dec;10(12):2535-43. [4] Jin DY, Tie JK, Stafford DW. The conversion of vitamin K epoxide to vitamin K quinone and vitamin K quinone to vitamin K hydroquinone uses the same active site cysteines. Biochemistry 2007 Jun 19;46(24):7279-83. [5] Wallin R, Wajih N, Hutson SM. VKORC1: a warfarin-sensitive enzyme in vitamin K metabolism and biosynthesis of vitamin K-dependent blood coagulation factors. Vitam Horm 2008;78:227-46. [6] Tie JK, Stafford DW. Structural and functional insights into enzymes of the vitamin K cycle. J Thromb Haemost 2016 Feb;14(2):236-47. [7] Chatron N., Chalmond B., Trouvé A., Benoît E., Caruel H., Lattard V., Tchertanov L. (2017). Identification of the Functional States of Human Vitamin K Epoxide Reductase from Molecular Dynamics Simulations. RSC Advances, 7, 52071 – 52090.