Thèse en cours

Mécanismes d'activation de VKORC1 mutée: de la modélisation et la simulation de dynamique moléculaire à une nouvelle stratégie de modulation de la fonction enzymatique

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Auteur / Autrice : Maksim Stoliarchuk
Direction : Luba Tchertanov
Type : Projet de thèse
Discipline(s) : Biologie
Date : Inscription en doctorat le 11/07/2019
Etablissement(s) : université Paris-Saclay
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale INTERFACES : approches interdisciplinaires, fondements, applications et innovation
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de mathématiques et de leurs applications (1990-2019 ; Cachan, Val-de-Marne)
référent : École normale supérieure Paris-Saclay (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 1912-....)

Résumé

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Notre recherche sur les effets des mutations sur les cibles attire l’attention de partenaires industriels. Un nouveau projet de recherche sur l’impact des mutations des VKORs – cible des anticoagulantes orales antivitamines K (AVKs), utilisés chez l’homme pour la prévention de la survenue de phénomènes thrombo-emboliques [1-3], est lancée sous forme d’un contrat industriel (LIPHATECH/VetAgro de Lyon). Nous poursuivons trois axes de recherche – (i) étude du mécanisme de l’activation enzymatique, (ii) description de l’alternance de l’activation provoquée par les mutations et (iii) compréhension du rôle des mutations sur la résistance aux AVKs. VKORC1 est une enzyme membranaire du réticulum endoplasmique, responsable de la réduction de la vitamine K époxyde en vitamine K quinone, activant la synthèse des facteurs de coagulation [4,5]. En l’absence de données structurales, plusieurs modèles topologiques de VKORC1 (de 3 à 5 hélices transmembranaires), ont été proposés par différents groupes des chercheurs [6]. Ces modèles sont principalement basés sur les données biochimiques et biophysiques qui sont pour les VKORs fréquemment contradictoires. Par conséquent, la topologie de VKORC1 ainsi que l'implication des résidus de cystéine (strictement conservés chez toutes les VKORs) dans le mécanisme enzymatique de la protéine restent incertaines. Nous avons construit un modèle 3D de la VKORC1 humaine sauvage (hVKORC1WT) à l'échelle atomique [7]. Des multiples simulations de DM étendus (1µs) du modèle intégré sur la membrane, en considérant tous les résidus de Cys sous leur forme oxydée (SH), nous ont permis d'identifier les résidus de Cys les plus susceptibles de former des ponts disulfures [1 and références herein]. Nous avons décrit quatre conformations métastables de hVKORC1WT, mimant les états fonctionnels de la protéine. L’étude de la reconnaissance de la vitamine K en forme époxyde et en forme réduite par les conformations prédites de hVKORC1WT a mis en évidence la sélectivité réciproque de la cible et du ligand. Le rôle des conformations de hVKORC1WT ciblées par chaque forme de la vitamine K dans le mécanisme de réduction de la molécule a ainsi été caractérisé. Nous avons postulé le mécanisme enzymatique détaillé de hVKORC1WT et caractérisé les interactions entre la cible prédite - hVKORC1WT à l'état actif - et trois AVKs différents en termes d’énergie libre de liaison. Les valeurs de l'energie libre de liaison ont été corrélés avec les constantes d'inhibition mesurées in vivo, validant nos modèles, les prédictions théoriques et le protocole utilisé. Nous explorerons VKORC1 dans le contexte de mutants présentant une résistance élevée aux inhibiteurs utilisés pour contrôler la population de rats. Les principaux objectifs sont la description des mécanismes d'activation des mutants et la compréhension du mécanisme de résistance. Pour comprendre les mécanismes d’activation du VKOR, une étude d’interaction avec sa protéine partenaire (PP) et la description du transfert des protons de PP à VKOR (PP est la protéine disulfide isomérase (PDI)) sont absolument indispensables. Les livrables de cette étude seront (i) des éléments fondamentaux en biologie des enzymes et en biophysique (description à niveau atomistique des mécanismes d’activation par échange de proton), (ii) des détails cruciaux en vue de leur application dans le développement de nouvelles molécules efficaces contre l’activation anormale des enzymes résistantes (définition des cibles-sites − le site catalytique des mutants et le site d’interaction du VKOR avec le partenaire), et (iii) le protocole bioinformatique applicable pour l’étude des autre enzymes. La prédiction numérique sera comparée aux mesures empiriques, qui seront réalisées à VetAgroSup Lyon et à IMOPA CNRS, Université de Lorraine (les partenaires du projet ANR ROC). Références: [1] Weston BW, Monahan PE. Familial deficiency of vitamin K-dependent clotting factors. Haemophilia 2008 Nov;14(6):1209-13. [2] Teichert M, Visser LE, van Schaik RH, Hofman A, Uitterlinden AG, DeSmet PA, et al. Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 (VKORC1) polymorphism and aortic calcification: the Rotterdam Study. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2008 Apr;28(4):771-6. [3] Hodroge A, Matagrin B, Moreau C, Fourel I, Hammed A, Benoit E, et al. VKORC1 mutations detected in patients resistant to vitamin K antagonists are not all associated with a resistant VKOR activity. J Thromb Haemost 2012 Dec;10(12):2535-43. [4] Jin DY, Tie JK, Stafford DW. The conversion of vitamin K epoxide to vitamin K quinone and vitamin K quinone to vitamin K hydroquinone uses the same active site cysteines. Biochemistry 2007 Jun 19;46(24):7279-83. [5] Wallin R, Wajih N, Hutson SM. VKORC1: a warfarin-sensitive enzyme in vitamin K metabolism and biosynthesis of vitamin K-dependent blood coagulation factors. Vitam Horm 2008;78:227-46. [6] Tie JK, Stafford DW. Structural and functional insights into enzymes of the vitamin K cycle. J Thromb Haemost 2016 Feb;14(2):236-47. [7] Chatron N., Chalmond B., Trouvé A., Benoît E., Caruel H., Lattard V., Tchertanov L. (2017). Identification of the Functional States of Human Vitamin K Epoxide Reductase from Molecular Dynamics Simulations. RSC Advances, 7, 52071 – 52090.