Origami d'ADN pour la spectrométrie de masse spatio-temporelle

DNA origami for spatio-temporal mass spectrometry

• Auteur / Autrice : Debarpan Ghosh
• Direction : Ludger Johannes
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2020
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Signalisations et réseaux intégratifs en biologie
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cnrs UMR 3666/ Inserm U 1143 - Chimie biologique des membranes et ciblage thérapeutique
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)

Mots clés

Mots clés libres

Origami d'ADN

Endocytose

Hypothèse GL-Lect

Isolation des vésicules

Multi-omique

DNA origami

Endocytosis

GL-Lect hypothesis

Vesicle isolation

Multi-omics

Résumé

L'endocytose de molécules de la membrane plasmique est essentielle pour des fonctions physiologiques telles que la signalisation, le renouvellement des membranes, la neurotransmission, le métabolisme et l'invasion de pathogènes. Ce processus d'internalisation est fortement régulé par l'interaction entre des protéines, lipides et glycanes spécifiques. Des mécanismes d'endocytose distincts existent et fonctionnent en parallèle, chacun associé à une composition moléculaire des structures endocytiques différente. Notre laboratoire a récemment découvert que la glycosylation des protéines et des lipides est essentielle pour certains événements d'endocytose non médiés par la clathrine, mais dépendant des glyco-lipides et les lectines (GL-Lect). Les galectines sont une famille de 15 lectines qui reconnaissent les glycanes sur les glycoprotéines de la membrane plasmique (cargos) et en contrôlent l'endocytose. Elles constituent donc l'outil idéal pour étudier les événements endocytiques dépendant de la glycosylation des protéines cargo. De plus, les glycolipides étant nécessaires à la déformation membranaire induite lors de l'endocytose GL-Lect, nous souhaitons également déterminer l'enrichissement en glycolipides de ces structures d'endocytose. Notre hypothèse est que les différentes structures endocytiques induites par les différentes galectines ont un glycocode protéique et lipidique unique, déterminant pour le destin intracellulaire des molécules internalisées. Pour déterminer la composition en protéines, lipides et glycanes de ces structures endocytiques, il est essentiel de les purifier spécifiquement par rapport à la lectine qui leur est associée. Bien que les protocoles d'isolement (immuno-isolation ou centrifugation différentielle) des compartiments subcellulaires pour la protéomique soient optimisés, ils ne peuvent pas être utilisés pour obtenir une spécificité de voie ou de cargo puisque la plupart des ligands et lectines sont localisés dans la partie luminale des structures endocytiques. En outre, l'approche APEX de biotinylation proximale peut être appliquée pour déterminer le protéome spécifique de la voie, mais pas le lipidome. C'est pourquoi nous avons développé une méthode nouvelle et universelle basée sur des particules superparamagnétiques enfermées dans des origamis d'ADN, fonctionnalisées avec différentes galectines. L'origami d'ADN a été construit sur la base d'un ADN simple brin (ss) dérivé de l'ADN du phage m13mp18. Ce brin d'échafaudage constitue une base d'agrafage d'ADN ss pour former un nanotube d'ADN monofonctionnalisé par une galectine d'intérêt. La lumière du nanotube d'ADN est chargée soit de nanoparticules magnétiques (NP) pour des applications de pulldown, soit d'APEX pour la microscopie électronique, ou de quantum dots pour le suivi de particule isolée. Les galectines couplées au nanotube d'ADN agissent ainsi comme des vecteurs pour délivrer le nanotube d'ADN dans les structures endocytiques précoces qu'elles induisent. Pour les études de validation de concept, nous avons choisi la galectine-8 (Gal8), en raison de son rôle de récepteur de pathogènes et de sa dérégulation dans des contextes tumoraux. Des expériences d'immunofluorescence ont montré que les nanotubes d'ADN couplés à Gal8 se lient et s'internalisent avec succès dans les cellules cancéreuses de la prostate PC3, en fonction du ligand. Nous avons ensuite mis en place un protocole d'internalisation de ces nanotubes et de lyse mécanique des cellules permettant la purification de populations de vésicules magnétiques remplies de fer, spécifiques des différentes galectines, pour une analyse multi-omique du contenu protéique et lipidique de ces structures endocytiques. Dans une première application, cette nouvelle approche nous a ainsi permis d'identifier pour la première fois l'anatomie moléculaire (cargos intégrines et protéines Rab) des structures d'endocytose qui sont spécifiques de la Gal8.

The endocytosis of extracellular and plasma membrane-localised molecules is essential for different physiological functions like signaling, membrane turnover, neurotransmission, metabolism, and invasion of pathogens. This internalisation process is highly regulated by the interplay of specific proteins, lipids and glycans. Distinct endocytic mechanisms exist and operate in parallel, hence the molecular composition of endocytic uptake structures may be different in each case. Our lab recently discovered that glycosylation patterns on proteins and lipids are critical for certain non-clathrin-mediated endocytic events, termed GlycoLipid-Lectin (GL-Lect) driven endocytosis. The extracellular parts of almost all membrane proteins are N- or O-glycosylated. Galectins are a 15-member family of lectins that recognise glycans on plasma glycoproteins (cargoes) and initiate endocytosis. Hence, galectins were the perfect tool to study glycosylation-specific endocytic events of cargo proteins. In addition, since glycolipids are required for the membrane deformation in GL-Lect driven endocytosis, we are interested to also determine glycolipid enrichment in endocytic structures. Our hypothesis is that different endocytic carrier populations induced by individual galectins have a unique protein and lipid glycocode, which might then also be critical for the final intracellular fate of the internalized molecules. To determine the protein, lipid, and glycan composition of endocytic carriers, it is critical to purify them in a ligand-specific manner. Although protocols for isolation of subcellular compartments for proteomics based on differential velocity or density gradient centrifugation have been excellently optimized, they cannot be used to achieve pathway or cargo specificity since most endocytic ligands and lectins are luminally localized. Immuno-isolation cannot be applied to luminal lectins, proximal biotinylation approach using APEX can be applied to determine the pathway-specific proteome, but not the lipidome. In addition, APEX does not directly target proteins on the cytosolic leaflet of endocytic vesicles. Therefore, we have developed a novel and universal method based on DNA origami-enclosed superparamagnetic particles, monofunctionalized by design with different galectins. The DNA origami was built based on a 14-helix model using a single stranded DNA derived from m13mp18 phage DNA as the backbone. This scaffold strand was shaped by a cocktail of ss-DNA staple oligonucleotides to form a DNA nanotube that is mono-functionalized on the outer wall with a chosen galectin (or any other endocytic protein of interest). Via the biotin-streptavidin bond, the lumen of the DNA nanotube is filled with magnetic nanoparticles (NP) for pulldown, APEX for electron microscopy, or a quantum dot for single particle tracking. The galectins, which are coupled to the DNA nanotube by an inverted protein coupling strategy, act as drivers to deliver the DNA nanotube into early endocytic uptake carriers that they themselves induce. For proof-of-concept studies, we have chosen galectin-8 (Gal8), based on its role as a pathogen receptor and its documented dysregulation in cancer. Immunofluorescence experiments showed successful binding and internalization of the Gal8-coupled DNA nanotubes in PC3 prostate cancer cells in a ligand dependent manner. For multi-omics, the Gal8-coupled DNA nanotubes are internalized for 3 to 10 min into PC3 cells. After removal of cell surface exposed DNA nanotubes, cells are mechanically lysed. The individual galectin-specific populations of iron-filled vesicles are purified by a magnetic-enhancement based method. The resulting carrier-specific protein and lipid fractions are analyzed by proteomics, lipidomics, and glycomics. In a first application, this new approach has allowed me to identify for the first time the molecular anatomy (e.g., integrin cargoes and Rab proteins) of endocytic structures that are specific to Gal8.