Thèse en cours

Origami d'ADN pour la spectrométrie de masse spatio-temporelle

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Auteur / Autrice : Debarpan Ghosh
Direction : Ludger Johannes
Type : Projet de thèse
Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Date : Inscription en doctorat le 01/10/2020
Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Signalisations et réseaux intégratifs en biologie
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cnrs UMR 3666/ Inserm U 1143 - Chimie biologique des membranes et ciblage thérapeutique
établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)

Résumé

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L'endocytose de molécules de la membrane plasmique est essentielle pour des fonctions physiologiques telles que la signalisation, le renouvellement des membranes, la neurotransmission, le métabolisme et l'invasion de pathogènes. Ce processus d'internalisation est fortement régulé par l'interaction entre des protéines, lipides et glycanes spécifiques. Des mécanismes d'endocytose distincts existent et fonctionnent en parallèle, chacun associé à une composition moléculaire des structures endocytiques différente. Notre laboratoire a récemment découvert que la glycosylation des protéines et des lipides est essentielle pour certains événements d'endocytose non médiés par la clathrine, mais dépendant des glyco-lipides et les lectines (GL-Lect). Les galectines sont une famille de 15 lectines qui reconnaissent les glycanes sur les glycoprotéines de la membrane plasmique (cargos) et en contrôlent l'endocytose. Elles constituent donc l'outil idéal pour étudier les événements endocytiques dépendant de la glycosylation des protéines cargo. De plus, les glycolipides étant nécessaires à la déformation membranaire induite lors de l'endocytose GL-Lect, nous souhaitons également déterminer l'enrichissement en glycolipides de ces structures d'endocytose. Notre hypothèse est que les différentes structures endocytiques induites par les différentes galectines ont un glycocode protéique et lipidique unique, déterminant pour le destin intracellulaire des molécules internalisées. Pour déterminer la composition en protéines, lipides et glycanes de ces structures endocytiques, il est essentiel de les purifier spécifiquement par rapport à la lectine qui leur est associée. Bien que les protocoles d'isolement (immuno-isolation ou centrifugation différentielle) des compartiments subcellulaires pour la protéomique soient optimisés, ils ne peuvent pas être utilisés pour obtenir une spécificité de voie ou de cargo puisque la plupart des ligands et lectines sont localisés dans la partie luminale des structures endocytiques. En outre, l'approche APEX de biotinylation proximale peut être appliquée pour déterminer le protéome spécifique de la voie, mais pas le lipidome. C'est pourquoi nous avons développé une méthode nouvelle et universelle basée sur des particules superparamagnétiques enfermées dans des origamis d'ADN, fonctionnalisées avec différentes galectines. L'origami d'ADN a été construit sur la base d'un ADN simple brin (ss) dérivé de l'ADN du phage m13mp18. Ce brin d'échafaudage constitue une base d'agrafage d'ADN ss pour former un nanotube d'ADN monofonctionnalisé par une galectine d'intérêt. La lumière du nanotube d'ADN est chargée soit de nanoparticules magnétiques (NP) pour des applications de pulldown, soit d'APEX pour la microscopie électronique, ou de quantum dots pour le suivi de particule isolée. Les galectines couplées au nanotube d'ADN agissent ainsi comme des vecteurs pour délivrer le nanotube d'ADN dans les structures endocytiques précoces qu'elles induisent. Pour les études de validation de concept, nous avons choisi la galectine-8 (Gal8), en raison de son rôle de récepteur de pathogènes et de sa dérégulation dans des contextes tumoraux. Des expériences d'immunofluorescence ont montré que les nanotubes d'ADN couplés à Gal8 se lient et s'internalisent avec succès dans les cellules cancéreuses de la prostate PC3, en fonction du ligand. Nous avons ensuite mis en place un protocole d'internalisation de ces nanotubes et de lyse mécanique des cellules permettant la purification de populations de vésicules magnétiques remplies de fer, spécifiques des différentes galectines, pour une analyse multi-omique du contenu protéique et lipidique de ces structures endocytiques. Dans une première application, cette nouvelle approche nous a ainsi permis d'identifier pour la première fois l'anatomie moléculaire (cargos intégrines et protéines Rab) des structures d'endocytose qui sont spécifiques de la Gal8.