Développement d'approches innovantes de marquage isotopique pour la caractérisation par RMN d'anticorps monoclonaux produits en cellules CHO

par Arthur Giraud

Projet de thèse en Chimie Biologie

Sous la direction de Jérôme Boisbouvier, Elodie Crublet et de Oriane Frances.

Thèses en préparation à l'Université Grenoble Alpes , dans le cadre de École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble) , en partenariat avec Institut de Biologie Structurale (laboratoire) et de Groupe de RMN biomoleculaires (equipe de recherche) depuis le 06-01-2020 .


  • Résumé

    Le but de ce travail est de développer des outils de RMN innovants qui permettront de mieux caractériser la structure hautement ordonnée (HOS) de protéines complexes telles que les mAbs. La HOS d'une protéine thérapeutique est un paramètre clé à caractériser lors de l'évaluation de la robustesse du processus de bioproduction pharmaceutique et sa mesure représente un défi analytique important. En effet, les méthodes biophysiques actuellement disponibles ne sont pas suffisantes pour détecter des changements de conformation subtils. De ce fait, il est difficile d'expliquer l'origine structurale de la perte d'activité observée lors d'études de stress de ces molécules biothérapeutiques et cela rend complexe la compréhension de leurs voies de dégradation. Ce projet a pour objectif d'explorer les capacités de la RMN afin de renforcer la panoplie d'outils analytiques permettant de caractériser les produits biothérapeutiques tels que les mAbs et ainsi d'accélérer le développement des produits biothérapeutiques de Sanofi. La RMN est un outil très puissant permettant de fournir des données reproductibles sur le contrôle de la qualité de composés biologiques. C'est également une technique très fiable pour avoir accès à une mine d'informations sur la structure et la dynamique des biomolécules en solution à résolution atomique. L'utilisation de cette technique pourrait ainsi grandement contribuer à notre compréhension des processus biologiques. Elle constituerait une approche rationnelle pour la résolution de problèmes liés aux processus de R &D en caractérisant les biomédicaments à chaque étape de la production biopharmaceutique. La RMN, dans ses conditions de marquage standard, a longtemps été limitée à l'étude de protéines de petite taille (<30 kDa). Cependant, au cours des 15 dernières années, d'énormes progrès ont été réalisés en matière de marquage spécifique des méthyles, ce qui a permis l'étude par RMN d'assemblages de haut poids moléculaire atteignant 1 MDa. Il a été récemment démontré dans la littérature que l'empreinte spectrale collectée grâce à des spectres RMN 2D 1H 13C en abondance naturelle fournissait des données HOS à haute résolution pour des anticorps monoclonaux (~ 150 kDa). Cependant, bien que cette approche de comparaison d'empreintes digitales soit un outil très puissant et efficace pour le contrôle qualité des mAbs, elle ne donne pas accès à des informations structurales approfondies. Il est donc important d'obtenir des échantillons de mAbs enrichis isotopiquement pour une caractérisation RMN plus complète des anticorps, en les produisant directement dans les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary cells) utilisées en routine pour la production industrielle des mAbs. Au cours de cette thèse, une première étape consistera à développer un nouveau milieu de culture en cellules CHO afin de permettre l'expression de protéines marquées isotopiquement (1H 13C) sur les méthyles. L'équipe de l'IBS ayant récemment réussi à produire un milieu riche marqué pour la culture en cellules eucaryotes (cellules d'insecte Sf9), nous sommes convaincus que le doctorant sera capable de développer un milieu de culture approprié pour la production d'anticorps marqués en cellules CHO. L'anticorps ainsi produit dans le nouveau milieu de culture sera ensuite analysé par RMN pour attribuer chaque signal du spectre. Afin de faciliter cette tâche, l'anticorps pourra être clivé en domaines Fab et Fc pour une attribution séparée de ces fragments. Le deuterium étant toxique pour ces cellules eucaryotes, la deutération ne sera pas de 99% comme pour les protéines habituellement produites en bactérie. Si la protonation résiduelle (d'environ 20‐40%) diminue la qualité des spectres RMN et affecte le processus d'attribution, les domaines pourront alternativement être produits in vitro dans un milieu perdeutéré. L'attribution ainsi effectuée pourra ensuite être transférée sur les spectres RMN de l'anticorps produit en cellules CHO. Pour les résonances correspondant aux résidus dont l'environnement est affecté par les modifications post‐traductionnelles ou pour les résidus situés à l'interface de domaines, des approches de mutagenèse seront utilisées pour finaliser l'attribution. L'attribution complète du mAb donnera alors accès à une large gamme d'informations permettant de mieux le caractériser. Une troisième étape consistera ainsi en l'acquisition et l'interprétation d'expériences d'interactions et de dynamique par RMN sur le mAb entier marqué. Ce travail permettra d'obtenir une compréhension plus complète et approfondie de l'anticorps d'un point de vue structural et dynamique et d'accéder aux propriétés conformationnelles et mouvements locaux, ainsi qu'aux interactions avec les partenaires et à la cartographie des épitopes. Ces données permettront ainsi d'expliquer l'activité biologique de l'anticorps d'un point de vue structural et dynamique.

  • Titre traduit

    Development of innovative isotopic labelling approaches to characterize by NMR mAbs produced in CHO cells


  • Résumé

    The aims of this pHD is to develop innovative tools for a better characterization of higher order structure (HOS) complex proteins such as mAbs. HOS information of biotherapeutics proteins is a key parameter in evaluating the robustness of the pharmaceutical bioproduction process. But HOS characterisation is a significant analytical challenge. Today's biophysical methods alone are not enough to detect subtill conformational changes. Hence during biotherapeutic molecule stress studies, the origin of the activity loss caused by its structure is difficult to explain making its deterioration pathway complex to apprehend. The objective of this project is to explore NMR's abilities in order to provide a wide range of analytical tools enabling the characterisation of biotherapeutic products such as mAbs, and therefor accelerating Sanofi's biotherapeutic product development. The NMR is a very powerful tool enabling the quality control of biological compounds through repeatable data. It is also a very reliable technique that provides a rich source of information on the structure and dynamics of biomolecules in solution at atomic scale. This analytical tool therefor provides a better understanding of biological processes and leads to a more rational approach in R&D problem solving by characterizing biomedicine at each stage of the biopharmaceutical production. For a long time, the use of RMN with standard labelling conditions was limited to the study of small size proteins (>30 kDa). However, during the last 15 years huge advancements in methyl specific labelling were achieved enabling the NMR study of high molecular mass molecules up to 1 MDa. It has recently been demonstrated in literature that the spectral fingerprint collected by naturally occurring abundant 1H 13C 2D NMR spectra provided high resolution HOS data for monoclonal antibodies (~ 150 kDa). Even though digital fingerprint comparison is an efficient mAbs quality control technique, it does not provide deep insights on structural information. Therefor it is important to obtain isotopically enriched mAbs samples for a more in-depth NMR characterisation of antibodies. These mAbs samples are produced directly by CHO cell (Chinese Hamster Ovary cells) cultures used routinely in the industrial production of mAbs. During this PhD, the first step consists in developing a new medium used in CHO cell culture in order to obtain methyl isotopic labelled (1H 13C) proteins. IBS team has recently succeeded in producing rich labelled mediums for eukaryotic cell culture (insect cells Sf9). We are convinced that the PhD student will be able to develop a suitable culture medium for the production of labelled antibodies in CHO cells. The labelled antibody will then be analysed by NMR for spectral peak assignment. In order to facilitate this task, the antibody can then be cleaved into Fab and Fc part for a separate peak assignment of these fragments. Because of deuterium toxicity for eukaryotic cells, deuteration won't reach 99% as for usually produced proteins in bacteria. If residual protonation (around 20 to 40%) decreases NMR spectral quality and affect assignement process, fragments could alternately be produced in vitro in perdeuterated medium. This attribution can then be transferred onto the antibody NMR spectrum obtained through CHO cell culture. In order to finalise the attribution, the mutagenesis approaches will be used for residues who have their resonance disrupted by post-translational modification or for interface domain residues. A complete attribution opens the door to a wide range of information enabling a better characterisation of the mAb. A final step will consist in the acquisition and the interpretation of dynamic and interactive experiments by NMR on the labelled mAb as a whole. This work leads to a better understanding of antibody structure and dynamic, conformational properties, local movement, as well as interactions and epitopes mapping.This data will enable to explain the antibody biological activity from a structural and dynamic point of view.