Développement et ingénierie d'anticorps recombinants ''sur-mesure'' par phage display pour des applications de diagnostic médical

Development and recombinant antibody engineering using phage display for medical diagnostic applications

• Auteur / Autrice : Romain Pantigny
• Direction : Pierre Martineau
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 03/07/2024
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IRCM - Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Criblage fonctionnel et criblage du cancer.
• Jury : Président / Présidente : Marie-Alix Poul
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre Martineau, Soizic Daniel, Pierre Lafaye, Gisèle Clofent-sanchez, Patrick Chames
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Pierre Lafaye, Gisèle Clofent-sanchez

Mots clés

Mots clés libres

Développement d'anticorps recombinants

Phage display

Flavivirus

Diagnostic

Antibody discovery

Phage display

Flavivirus

Diagnosis

Résumé

Le rôle des anticorps dans le domaine du diagnostic s’est considérablement étendu durant ces dernières années, notamment dans des applications immuno-enzymatiques et les immunoessais. L’enjeu est de proposer des tests de diagnostic fiables, sensibles et spécifiques dans le but d’améliorer l’identification des maladies et la prise en charge des patients. Classiquement, les anticorps monoclonaux utilisés dans les tests de diagnostic sont générés par la technique d’hybridation lymphocytaire. Cette technique implique l’immunisation de souris avec la cible d’intérêt et l’étude de la spécificité n’est possible qu’après obtention des anticorps. A l’inverse, le développement d’anticorps par phage display permet i) l’obtention d’anticorps recombinants sous différents formats en s’affranchissant des immunisations et ii) de moduler et de sélectionner des anticorps « sur-mesure » en amont, dès l’étape de sélection. L’objectif principal de mon travail de thèse consiste à générer des anticorps performants à usage diagnostique grâce au phage display sur un modèle présentant des défis de développement. Le choix de notre modèle d’étude pour développer des anticorps s’est orienté vers la protéine non-structurale 1 (NS1) des Flavivirus (Dengue, Zika, Fièvre jaune…), un biomarqueur de la phase aigüe de l’infection de ces maladies infectieuses émergentes. Nous avons développé des anticorps anti-NS1 Zika par phage display et mis en évidence qu’ils étaient plus spécifiques que les anticorps développés par la technique d’hybridation lymphocytaire vis-à-vis des autres NS1 des Flavivirus. D’autre part, les anticorps développés par phage display sont moins sensibles que les anticorps développés par hybridation lymphocytaire. Nous avons combiné les caractéristiques de spécificité et sensibilité des anticorps issus des deux techniques dans un prototype immunoessai en sandwich dans l’instrument VIDAS®. Cette étude démontre que les caractéristiques des anticorps issus d’hybridation lymphocytaire et de phage display peuvent être complémentaires pour développer un test de diagnostic sensible et spécifique. En parallèle, nous avons développé des anticorps pan-NS1 Flavivirus. Nous avons mis en place une stratégie de sélection « cross-panning » par phage display pour orienter la sélection vers des anticorps capables de reconnaître plusieurs NS1 de Flavivirus grâce à des domaines structuraux communs entre elles. Les anticorps obtenus sont capables de reconnaître les NS1 Zika, Dengue 2 et 3, Fièvre jaune et West-Nile. L’obtention de tels anticorps démontre l’intérêt du phage display grâce à la modulation des conditions de sélection. Ceci permettra d’éviter de larges screening avec des méthodes conventionnelles, comme la technique d’hybridation lymphocytaire, pour obtenir un anticorps optimal.

The role of antibodies in the diagnostic field has expanded considerably in recent years, particularly in immunoassay applications. The challenge is to offer reliable, sensitive and specific diagnostic tests, with the aim of improving disease identification and patient management. Classically, monoclonal antibodies used in diagnostic tests are generated by the hybridoma technique. This technique involves immunizing mice with the target of interest, and specificity can only be studied once the antibodies have been obtained. On the other hand, the development of antibodies using the phage display technique allows i) to obtain recombinant antibodies in a variety of formats without the need for immunization, and ii) to modulate and select ''tailor-made'' antibodies at the biopanning stage. The main aim of my thesis is to generate performant antibodies for diagnostic application using the phage display technique on a challenging model. Our model for antibody development is the non-structural protein 1 (NS1) of Flaviviruses (Dengue, Zika, Yellow Fever...), a biomarker of the acute phase of infection of these emerging infectious diseases. We developed anti-NS1 Zika antibodies using the phage display technique and demonstrated that they are more specific than hybridoma antibodies against other Flaviviruses NS1. On the other hand, phage display antibodies are less sensitive than hybridoma antibodies. We have combined the specificity and sensitivity characteristics of antibodies from both techniques in a sandwich immunoassay prototype in the VIDAS® instrument. This study demonstrates that hybridoma and phage display antibodies characteristics could be complementary to develop a sensitive and specific immunoassay. In parallel, we have developed pan Flavivirus NS1 antibodies. We have set-up a cross-panning phage display selection strategy to orientate selection towards antibodies recognizing several flaviviruses NS1 thanks to common structural domains shared between them. Antibodies obtained can recognize Zika, Dengue 2 and 3, Yellow Fever and West-Nile NS1. This demonstrates the advantage of the phage display technique by modulating biopanning conditions. This will avoid extensive screening with conventional methods, such as the hybridoma technique, to obtain an optimal antibody.