Étude à l'échelle d'une seule molécule de la nucléation et de l'agrégation de la protéine tau 1N4R avec des pinces magnétiques

Single-molecule investigation of 1N4R tau protein nucleation and aggregation with magnetic tweezers

• Auteur / Autrice : Tobias Tigges
• Direction : Charlie Gosse
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Microbiologie et immunologie
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 23/11/2023
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie de l'École normale supérieure (Paris ; 2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Moteurs et machines moléculaires
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École normale supérieure (Paris ; 1985-....)
• Jury : Président / Présidente : Damien Baigl
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Charlie Gosse, Guillaume Romet-lemonne, Carmen Nussbaum-krammer, Claire Valotteau
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Guillaume Romet-lemonne, Carmen Nussbaum-krammer

Mots clés

Mots clés libres

Pinces magnétiques

Biophysique

Alzheimer

Multidisciplinaire

Magnetic tweezers

Biophysics

Alzheimer

Multidisciplinary

Résumé

Ce doctorat se concentre sur l'interaction entre monomères et fibrilles de la protéine tau au niveau de la molécule unique, visant à élucider le mécanisme d'agrégation dans la maladie d'Alzheimer. Un tag ybbR a été ajouté au N-terminus de la protéine tau 1N4R pour la manipulation moléculaire. Les monomères et fibrilles de 50 nm ont été couplés à des oligonucléotides via la Sfp transférase, puis reliés à un échafaudage d'ADN. Ce montage, comparable à des pinces, permet d'ajuster la proximité des entités interactives. Chaque construct est fixé entre une lamelle de verre et une perle magnétique, manipulable par des pinces magnétiques pour varier la force appliquée et surveiller l'état d'interaction. Une liaison ADN de 180 nm permet de multiples sondages des mêmes couples moléculaires. Nous avons confirmé que le tag ybbR ne modifie pas la capacité des tau à former des fibrilles. Des analyses de microscopie électronique et de fluorescence au thioflavine T ont montré des cinétiques typiques d'agrégation pour les protéines mutantes et sauvages. L'utilisation de fibrilles marquées Atto-488 et de monomères marqués Atto-550 a révélé que l'extension des fibrilles se fait principalement à une extrémité. Les expériences à molécule unique ont révélé deux types de comportements pour les couples monomère-monomère, indiquant au moins deux conformations de tau. L'ajout d'héparine a presque totalement éliminé ces événements de liaison, suggérant le rôle des polyanions dans la nucléation des fibrilles. Pour les interactions monomère-fibrille, les mesures étaient complexifiées par la taille variable des fibrilles et leur attachement aléatoire sur l'échafaudage. Cependant, nous avons identifié des motifs spécifiques d'interaction, que l'ajout d'héparine a considérablement réduits, appuyant l'idée que l'héparine favorise des conformations protéiques spécifiques à l'agrégation. En conclusion, l'association des pinces magnétiques et de l'échafaudage d'ADN offre un aperçu précieux des interactions entre monomères et fibrilles de tau. Les mesures directes révèlent des informations essentielles sur les premières étapes de l'agrégation, mais des développements sont nécessaires pour affiner cette approche biophysique. La recherche future devrait aussi caractériser les interactions de tau avec d'autres protéines pour mieux comprendre l'agrégation protéique et les maladies neurodégénératives.

This PhD focuses, at the single-molecule level, on the interaction between tau protein monomers and fibrils. It aimed at bringing new mechanistic information on the aggregation process observed in Alzheimer's disease. To micromanipulate individual molecular entities, we introduced a ybbR tag at the N-terminus of the 1N4R tau protein, a sequence part being structurally not implied in aggregation. Monomers and 50 nm-long fibrils were then coupled by Sfp transferase to coenzyme A-oligonucleotides, so as to allow the ligation of the resulting conjugates to a scaffold made of DNA. The anatomy of the latter molecular construct is reminiscent of that of forceps: the interacting partners face each other at the tips and can be brought in close proximity or separated when actuating the shanks. More precisely, each scaffold is tethered between a glass slide and a magnetic bead and mounted on a magnetic tweezers setup enabling to vary the applied force and to monitor the interaction status. At constant force, each increase in the bead altitude signs a dissociation event. Importantly, with a 180 nm-long DNA leash connecting the two partners, the same single couples can be probed tens to hundred times during day-long experiments. First, we ensured that the ybbR tag did not alter taus’ ability to form fibrils. For wild type and mutant proteins transmission electron microscopy analysis evidenced similar aggregate morphologies and bulk measurements relying on thioflavin t fluorescence indicated archetypal kinetics for fibrils, which were as well confirmed for standard and single-molecule buffers. Elongation experiments using Atto-488 labeled fibrils and Atto-550 labeled monomers enabled us to document the directionally of fibril growth: examination in confocal microscopy revealed that fibril extension occurred in more than 95% only at one end. In single-molecule experiments we evidenced that monomer-monomer couples displayed two distinct behavior types: Characteristic times of short (0.1 s) or a extended (1.5 s) duration. Since no shifting from one behavior to the other was noticed during measurements we explained these findings by the existence of at least two tau conformations in the functionalized tau population. The addition of heparin resulted in the nearly full disappearance of the binding events; complementing the current view on the favoring role of polyanions in fibril nucleation. For the monomer-fibril case, measurements were complexified by the geometrical and chemical considerations: fibrils are dispersed in size, they can be attached to the scaffold at any arbitrary position along their length, and, although fibrillar growth directionality could be confirmed, weak interactions between any position on the fibril and the monomer, could not be excluded. Additionally, some non-specific interaction of the fibrils to the scaffold were detected in absence of monomer at the other tip. Despite these hurdles, we could identify distinct patterns for the fibril-monomer interaction. Adding heparin lead to signal disappearing and narrowing down the reported amplitude of certain measures, supporting the claim of heparin favoring distinct protein confirmations prone for further aggregation. In conclusion, this research demonstrates that combining magnetic tweezers with DNA scaffold can provide valuable insights into the mechanisms of interactions between tau monomers and fibrils. Direct measurements at the single-molecule level offer model-free information on the early step of the aggregation. Yet, additional developments are required to fully potentialized the present biophysical approach. Several extensions of our study on tau protein aggregation can also be anticipated: We should focus on the broader context of protein aggregation and neurodegenerative diseases by characterizing the interactions of tau protein with other protein partners previously identified.