Identification et validation des déterminants de virulence des virus influenza équins circulants

Identification and validation of the virulence determinants of circulating equine influenza viruses

• Auteur / Autrice : Lena Kleij
• Direction : Bernard Delmas
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 11/12/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : VIM - Virologie et Immunologie Moléculaires
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université de Versailles-Saint-Quentin-en-Yvelines (1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Didier Poncet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Gaëlle Gonzalez, Sébastien Mathieu Soubies, Sandra Blaise-Boisseau
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Gaëlle Gonzalez, Sébastien Mathieu Soubies

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virulence

Sous-type H3N8 du virus de la grippe A

Grippe équine

Séquençage par nanopores

Cheval -- Maladies

Mots clés libres

Influenza équine

Virus influenza

Diagnostic

Déterminant de virulence

Équin

Séquençage

Equine influenza

Influenza virus

Diagnostic

Virulence determinant

Sequencing

Equine

Résumé

Les virus influenza sont des virus enveloppés, à ARN négatif segmenté en 8 segments génomiques. Ils sont classés dans la famille des Orthomyxoviridae. Ce sont les agents étiologiques de la grippe, une maladie respiratoire qui touche de nombreuses espèces mammifères et aviaires. La grippe équine est causée par les sous-types H3N8 et H7N7 du virus influenza de type A, ce dernier s'étant éteint depuis les années 1970. Malgré l'existence d'un vaccin, la France a connu plusieurs épidémies de H3N8 depuis les années 2000. Pour réduire l'impact économique important de ces épidémies pour l'industrie équine, il est nécessaire d'établir des tests de diagnostic rapides, robustes et applicables sur le terrain pour limiter au plus la circulation du virus et en identifier les déterminants de virulence et caractériser la dérive antigénique.Nous avons étudié les potentialités de la technique de séquençage dite « long read » développée par Oxford Nanopore Technologies. Nous avons réalisé une caractérisation du génome complet de deux virus H3N8 équins ayant circulé en France en 2009 et 2018 (A/équine/Paris/1/2018 et A/équine/Beuvron-en-Auge/2/2009, deux virus de la clade 1 Florida) ainsi que des deux souches du vaccin couramment utilisé en France.Nos résultats ont démontré la fiabilité de cette technique de séquençage à partir d'amplicons des huit segments génomiques des quatre virus analysés ainsi que la capacité à réaliser des lectures fiables à partir du séquençage direct des ARN viraux (résultats présentés dans une première partie). L'analyse de la séquence en acides aminés de l'hémagglutinine HA des souches circulantes ont mis en évidence une très légère dérive antigénique par rapport aux souches vaccinales avec des substitutions spécifiques comme T161I dans A/equine/Paris/1/2018 and N188T dans les souches post-2015, deux substitutions localisées dans le site antigénique B. Le site antigénique E montre également des modifications dans les souches post-2018, avec la substitution N63D.Le segment génomique 2 code pour une des trois sous-unités de l'ARN-polymérase virale, PB1 ainsi que pour une protéine accessoire, PB1-F2, d'un cadre de lecture alternatif. PB1-F2 est reconnu comme un déterminant de virulence. Alors que la souche A/équine/Paris/1/2018 code pour un variant de 90 acides aminés de long, de nombreuses souches, dont A/équine/Beuvron-en-Auge/2/2009, code pour un variant de seulement 81 résidus. Des essais biologiques et de biochimie ont été réalisés pour caractériser les propriétés de chacune de ces deux formes de PB1-F2. Dans un essai où la forme longue de PB1-F2 est exprimée en cellules eucaryotes sans autre constituant viraux, elle abolit le potentiel membranaire de la mitochondrie cellulaire. Mise en présence de vésicules synthétiques mimant la membrane externe de la mitochondrie, la forme longue de PB1-F2 les perméabilise plus efficacement que la forme courte. Les analyses de séquence en acides aminés des protéines virales (de HA et PB1-F2 essentiellement) sont présentées dans une deuxième partie.Afin de valider l'impact de PB1-F2 sur la virulence en contexte infection, nous avons cherché à établir un système de génétique inverse pour le virus A/équine/Paris/1/2018 (troisième partie). Pour se faire, les 8 segments génomiques ont été clonés dans le plasmide pRF483 permettant d'assurer la synthèse des brins d'ARN génomiques et l'expression des protéines virales. La séquence des inserts de chacun des plasmides a été validée. Pour valider le fonctionnement du complexe réplicatif codé par 4 des 8 segments viraux clonés dans pRF483 (PA, PB1, PB2 et NP), ces plasmides ont été transfectés avec un plasmide codant pour le segment génomique NA dans lequel son cadre de lecture a été substitué par un gène reporter, la luciférase. Dans ces conditions expérimentales, une activité du complexe ARN-polymérase a été détectée. Ces essais seront prolongés pour la production de virus recombinants par transfection des 8 plasmides construits.

Influenza viruses are enveloped, their genome being segmented into 8 negative RNA segments. They are classified in the Orthomyxoviridae family. They are the etiological agents of the flu, a respiratory disease that affects many mammalian and avian species. Equine influenza is caused by the H3N8 and H7N7 subtypes of the type A influenza virus, the latter being extinct since the 1970s. Despite the existence of a vaccine, France has experienced several H3N8 epidemics since the 2000s. To reduce the significant economic impact of these epidemics for the equine industry, it is necessary to establish rapid, robust, and on-terrain applicable diagnostic tests to limit the circulation of the virus as much as possible and identify its virulence determinants as well as characterize antigenic drift.We studied the potential of the so-called “long read” sequencing technique developed by Oxford Nanopore Technologies. We carried out a characterization of the complete genome of two equine H3N8 viruses that circulated in France in 2009 and 2018 (A/equine/Paris/1/2018 and A/equine/Beuvron-en-Auge/2/2009, two viruses of clade 1 Florida) as well as the two strains of the vaccine commonly used in France.Our results demonstrated the reliability of this sequencing technique using amplicons of the eight genomic segments of the four viruses analyzed as well as the ability to produce reliable readings from direct sequencing of viral RNA (results presented in the first part). Analysis of the amino acid sequence of hemagglutinin HA of circulating strains demonstrated a very slight antigenic drift compared to vaccine strains with specific substitutions such as T161I in A/equine/Paris/1/2018 and N188T in the post-2015 strains, two substitutions located in the antigenic site B. The antigenic site E also shows modifications in the post-2018 strains, with the N63D substitution.Genomic segment 2 encodes one of the three subunits of the viral RNA polymerase, PB1, as well as an accessory protein, PB1-F2, of an alternative reading frame. PB1-F2 is recognized as a virulence determinant. While the A/equine/Paris/1/2018 strain encodes a variant 90 amino acids long, many strains, including A/equine/Beuvron-en-Auge/2/2009, encode a variant only 81 residues. Biological and biochemical tests were carried out to characterize the properties of each of these two forms of PB1-F2. In an assay where the long form of PB1-F2 is expressed in eukaryotic cells without other viral constituents, it abolishes the membrane potential of the cellular mitochondria. Placed in the presence of synthetic vesicles mimicking the mitochondrial outer membrane, the long form of PB1-F2 permeabilizes them more effectively than the short form. Amino acid sequence analyzes of the viral proteins (mainly HA and PB1-F2) are presented in a second part.In order to validate the impact of PB1-F2 on virulence in an infectious context, we sought to establish a reverse genetics system for the A/equine/Paris/1/2018 virus (third part). To do this, the 8 genomic segments were cloned into the pRF483 plasmid to ensure the synthesis of genomic RNA strands and the expression of viral proteins. The sequence of the inserts of each of the plasmids was validated. To validate the functioning of the replicative complex encoded by 4 of the 8 viral segments cloned in pRF483 (PA, PB1, PB2 and NP), these plasmids were transfected with a plasmid coding for the NA genomic segment in which its reading frame was substituted. by a reporter gene, luciferase. Under these experimental conditions, activity of the RNA-polymerase complex was detected. These tests will be extended for the production of recombinant viruses by transfection of the 8 constructed plasmids.