Étude des mutations microsatellites par des approches basées sur l'utilisation de séquenceurs de première, deuxième et troisième génération

Study of microsatellite mutations using approaches based on first, second, and third-generation sequencers

• Auteur / Autrice : Sophie Jeanjean
• Direction : Alexandre How kit, Jean-François Deleuze
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 27/02/2025
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Fondation Jean Dausset-CEPH
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université d'Évry Val d'Essonne
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Florence Gonnet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Benoit Arcangioli, Julien Barc, Judith Lopes
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Benoit Arcangioli, Julien Barc

Mots clés

Mots clés contrôlés

Réparation de mésappariement de l'ADN

Mutation (biologie)

Séquençage à haut débit

Satellites (génétique)

Mots clés libres

Microsatellites

Modélisation

Ngs

Mutations

Système MMR

Microsatellites

Modelisation

Ngs

Mutations

MMR system

Résumé

Les microsatellites sont des séquences d'ADN répétées en tandem avec un motif de 1 à 6 nucléotides, présents dans presque tous les génomes. Leur taux de mutation élevé, responsable d'une évolution rapide, leur confère un haut niveau de polymorphisme basé sur le nombre de répétitions. Ils sont donc utilisés comme marqueurs génétiques dans de nombreuses applications biomédicales. Le principal mécanisme de mutation est le glissement de la polymérase lors de la réplication, provoquant des contractions (délétions) ou des expansions (insertions) des microsatellites. Ce processus présente un biais directionnel, avec une préférence pour les délétions chez les procaryotes et les insertions chez les eucaryotes. Le système de réparation des mésappariements (MMR) corrige ces erreurs et réduit fortement le taux de mutation. Plusieurs facteurs influencent les mutations des microsatellites. Parmi les facteurs endogènes, on trouve la composition nucléotidique, la taille et le nombre de répétitions. Les facteurs exogènes incluent la taille du microsatellite et l'efficacité du système MMR. Mon projet de thèse visait à étudier et caractériser ces mutations à l'aide de séquenceurs de première, deuxième et troisième génération. Il se divisait en trois parties principales. Dans la première partie, j'ai contribué au développement d'une méthode d'inférence des taux de mutation, une mesure cruciale en génétique. Cette méthode permet d'identifier le modèle génétique à l'origine du glissement de la polymérase parmi 32 modèles considérés. Elle intègre des taux de délétion et d'insertion allant jusqu'à quatre sauts d'unités de répétition, avec une relation linéaire ou exponentielle entre le taux de mutation et le nombre d'unités. La méthode a été appliquée à des données expérimentales obtenues par amplification in vitro de microsatellites via PCR et méthode isotherme (RPA), combinées à l'analyse de fragments. Cela a révélé des différences mutationnelles significatives. Dans la deuxième partie, j'ai comparé différentes technologies de séquençage haut débit (NGS) pour déterminer la meilleure approche pour identifier la taille des allèles microsatellites. J'ai évalué diverses méthodes de préparation de librairies pour le séquençage à lecture courte avec la technologie Illumina, incluant des protocoles avec ou sans PCR (« PCR-free »), utilisant de 1 à 20 cycles PCR et incorporant ou non des codes-barres moléculaires. Un protocole sans PCR a été utilisé pour le séquençage à lecture longue avec la technologie PacBio. Mes résultats ont montré que le séquençage à lecture courte sans étape PCR est l'approche la plus fidèle. Enfin, dans la troisième partie, j'ai caractérisé les mutations des microsatellites en fonction de divers facteurs endogènes (unité́ répétée, nombre de répétitions) et exogènes (polymérase, température). J'ai développé un système rapporteur basé sur l'utilisation de plasmides contenant des microsatellites, combiné au séquençage capillaire et/ou NGS. Les études in vitro ont impliqué trois méthodes d'amplification ADN avec des températures allant de 15 à 65 °C. Les études in vivo ont été réalisées chez Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiae, utilisant des souches sauvages et déficientes en MMR, cultivées à des températures de 20 à 45 °C. Ces travaux ont révélé un effet modulateur de la température sur les mutations des microsatellites. En conclusion, ce travail a permis d'améliorer la caractérisation des mutations microsatellites grâce à des approches innovantes, mathématiques et technologiques, et a mis en évidence un nouveau facteur exogène influençant leur formation in vitro et in vivo.

Microsatellites are tandem repeat DNA sequences with motifs of 1 to 6 nucleotides, present in nearly all genomes. Their high mutation rate, driving rapid evolution, results in significant polymorphism based on the number of repeats. They are widely used as genetic markers in various biomedical applications. The primary mutation mechanism involves polymerase slippage during replication, leading to contractions (deletions) or expansions (insertions) of microsatellites. This process exhibits directional bias, favoring deletions in prokaryotes and insertions in eukaryotes. The mismatch repair system (MMR) corrects these errors, significantly reducing the mutation rate. Several factors influence microsatellite mutations. Endogenous factors include nucleotide composition, motif size, and repeat number. Exogenous factors include microsatellite size and MMR efficiency. My thesis project aimed to study and characterize these mutations using first-, second-, and third-generation sequencing technologies. It was divided into three main parts. In the first part, I contributed to the development of a method to infer mutation rates, a crucial measure in genetics. This method identifies the genetic model underlying polymerase slippage among 32 considered models. It accounts for deletion and insertion rates up to four repeat unit jumps, with linear or exponential relationships between mutation rates and repeat units. The method was applied to experimental data from in vitro microsatellite amplification via PCR and isothermal methods (RPA), combined with fragment analysis. This revealed significant mutational differences. In the second part, I compared various next-generation sequencing (NGS) technologies to identify the best approach for determining the length of microsatellite alleles. I evaluated library preparation methods for short-read sequencing with Illumina technology, including protocols with or without PCR (“PCR-free”), using 1 to 20 PCR cycles and incorporating molecular barcodes. A PCR-free protocol was used for long-read sequencing with PacBio technology. My results showed that short-read sequencing without PCR is the most reliable approach. Finally, in the third part, I characterized microsatellite mutations based on various endogenous (repeat unit, repeat number) and exogenous (polymerase, temperature) factors. I developed a reporter system using plasmids containing microsatellites combined with capillary and/or NGS sequencing. In vitro studies involved three DNA amplification methods across temperatures from 15 to 65 °C. In vivo studies were conducted in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, using wild-type and MMR-deficient strains grown at temperatures from 20 to 45 °C. These studies revealed a modulatory effect of temperature on microsatellite mutations. In conclusion, this work improved microsatellite mutation characterization through innovative mathematical and technological approaches, highlighting a novel exogenous factor influencing their formation in vitro and in vivo.