Étude de la traduction de l'ARN complet du MLV et VIH-1 au niveau d'une molécule unique

Study of the translation of the full-length RNA of MLV and HIV-1 at a single molecule level

• Auteur / Autrice : Felipe Leon diaz
• Direction : Marylène Mougel
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 31/10/2024
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IRIM - Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier
• Jury : Président / Présidente : Emmanuel Margeat
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marylène Mougel, Eugenia Basyuk, Serena Bernacchi, Hugues De rocquigny
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Serena Bernacchi, Hugues De rocquigny

Mots clés

Mots clés libres

Virus

Traduction

Transcription

Virologie

Microscopie

Virus de la Leucemie Murine

Virus

Translation

Transcription

Virology

Microscopy

Murine Leukemia Virus

Résumé

Les rétrovirus transcrivent un seul ARN de pleine longueur (ARN-FL) qui peut conserver des introns, contient une longue région 5'-UTR très structurée, et fonctionne soit comme un ARNm codant les protéines structurales clés Gag et enzymatiques (Pol), soit comme un génome sous forme de dimères pour de nouvelles particules virales. Nous avons entrepris une étude comparative de la traduction de l'ARN-FL de deux rétrovirus: MLV, décrit comme un rétrovirus simple et un modèle pour la recherche sur le cancer, et VIH-1, qui cause le SIDA et qui est le prototype des rétrovirus complexes. Tous deux ont un cycle de réplication similaire malgré leurs niveaux de complexité génétique très différents. La traduction de la polyprotéine Gag fait appel à des mécanismes complexes, notamment le balayage des ribosomes, des sites potentiels d'entrée interne des ribosomes (IRES) dans la région 5' UTR, et l'utilisation de mécanismes qui permettent aux ribosomes de contourner les codons stop, produisant une protéine de fusion Gag-Pol. De plus, MLV a la particularité de produire une forme glycosylée de Gag (gGag) qui utilise un codon CUG en amont du AUGGag standard. Nous avons utilisé la technologie SunTag (ST) combinée à l'imagerie ARN MS2 pour visualiser des molécules uniques d'ARN-FL et de Gag naissantes. Cette approche a permis l'observation en temps réel de la traduction au niveau d'une cellule unique. Notre étude révèle qu'une minorité seulement des molécules d'ARN-FL est utilisée comme ARNm pour la traduction : 19 % et 34 % des ARN-FL pour le MLV et le VIH-1, respectivement. De manière surprenante, les polysomes du MLV et du VIH-1 varient considérablement en termes d'occupation des ribosomes, avec 3 ribosomes par ARN-FL pour le MLV et 8 pour le VIH-1, ce qui indique une utilisation plus efficace de la machinerie de traduction de l'hôte par le VIH-1. Les études cinétiques avec le MLV, grâce à l'imagerie en temps réel, ont montré que la faible proportion d'ARN-FL en cours de traduction, peut être compensée par une cinétique de traduction rapide (taux d'élongation = 22 aa/sec), permettant la synthèse d'une quantité suffisante de protéines Gag pour assurer la progéniture virale. L'étude de mutants du domaine de nucléocapside (NC) de Gag a montré que la NC du VIH-1 (contrairement à celle du MLV) via ses motifs en doigt de zinc est essentielle pour le recrutement des ribosomes et la localisation de la traduction. Nous avons observé que les sites de traduction avaient des localisations cellulaires distinctes entre les virus, avec deux phénotypes principaux identifiés : périnucléaire et dispersé pour le VIH-1 et proche ou à la membrane plasmique pour le MLV, soulignant une régulation spatiale et temporelle de la traduction différente entre ces deux virus. Dans l'ensemble, ces résultats apportent de nouvelles perspectives sur les processus de traduction du MLV et du VIH-1, en particulier sur la manière dont le virus optimise sa traduction pour soutenir la réplication virale et l'assemblage du virus. Cette recherche fournit des informations précieuses sur la traduction de l'ARN rétroviral, soulignant la régulation sophistiquée de la synthèse des protéines virales. Ainsi, on pourra mieux comprendre comment les rétrovirus se répliquent et interagissent avec les cellules hôtes, avec des implications pour la virologie et le développement de stratégies antivirales. L'utilisation des techniques de microscopie dans cette étude pose les bases d'une exploration plus approfondie de la dynamique de la traduction virale au niveau moléculaire, puisqu'elles pourront être facilement adaptées à l'étude d'autres agents pathogènes.

Retroviruses transcribe a single, full-length RNA (FL-RNA) that can retain introns, contains a long, structured 5'-UTR, and functions either as an mRNA encoding the key structural Gag and enzymatic (Pol) proteins or as a genome in the form of dimers for new viral particles. We undertook a comparative study of the FL-RNA translation of two retroviruses: MLV, described as a simple retrovirus and a model for cancer research, and HIV-1, which causes AIDS and is the prototype of complex retroviruses. Both have a similar replication cycle, despite their very different levels of genetic complexity. Translation of the Gag polyprotein involves complex mechanisms, including ribosome scanning, potential internal ribosome entry sites (IRES) in the 5' UTR and the use of mechanisms that allow ribosomes to bypass stop codons, producing a Gag-Pol fusion protein. In addition, MLV has the particularity of producing a glycosylated form of Gag (gGag), which uses a CUG codon upstream of the standard AUGGag. We used the SunTag (ST) technology combined with MS2 RNA imaging to visualize single FL-RNA and single nascent Gag molecules. This approach allowed for real-time observation of translation at a single-cell level. Our study reveals that only a minority of the viral FL-RNA molecules are used as mRNA for translation:19% and 34% of FL-RNAs for MLV and HIV-1, respectively. Surprisingly, MLV and HIV-1 polysomes vary greatly in ribosome occupancy, with 3 ribosomes per FL-RNA for MLV and 8 for HIV-1, indicating a more efficient utilization of the host's translation machinery by HIV-1. Kinetic studies with MLV using real-time imaging showed that the low level of translating FL RNA can be compensated for by its fast translation kinetics (elongation rate = 22 aa/sec), allowing the synthesis of sufficient Gag proteins to ensure viral progeny. The study of nucleocapsid (NC) mutants showed that HIV-1 NC (unlike MLV NC) via its zinc-finger motifs is essential for ribosome recruitment and translation localization. The translation of FL-RNA was observed to occur in distinct cellular locations between viruses, with two main phenotypes identified: perinuclear and dispersed for HIV-1 and near/at the plasma membrane for MLV, highlighting different spatial and temporal regulation of translation between the two viruses. Overall, these findings provide new insights into the translation processes of MLV and HIV-1, in particular how the virus optimizes its translation to support viral replication and virus assembly. This research provides valuable information on retroviral RNA translation, highlighting the sophisticated regulation of viral protein synthesis. This will provide a better understanding of how retroviruses replicate and interact with host cells, with implications for virology and the development of antiviral strategies. The use of microscopy techniques in this study sets a foundation for further exploration of viral translation dynamics at the molecular level since it can be easily adapted to study other pathogens.