Caractérisation de la structure de la cornée humaine par microscopie de second harmonique résolue en polarisation

Characterization of the structure of human cornea by polarization-resolved second harmonic microscopy.

• Auteur / Autrice : Clothilde Raoux
• Direction : Marie-claire Schanne-klein
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Physique
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2018
• Etablissement(s) : Institut polytechnique de Paris
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de l'Institut polytechnique de Paris
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LOB - Laboratoire d'Optique et Biosciences

Mots clés

Mots clés libres

Biophotonique

Microscopie multiphoton

Shg

Cornée

Polarimétrie

Collagène

Biophotonics

Multiphoton microscopy

Shg

Cornée

Polarimetry

Collagen

Résumé

La cornée présente plusieurs propriétés physiologiques importantes, principalement la transparence et la réfraction, liées à des propriétés biomécaniques cruciales. Toutes ces propriétés sont étroitement liées à la structure du stroma, qui se compose de lamelles empilées de 1-3 µm d'épaisseur, constituées de fibrilles de collagène (25-30 mm de diamètre). Ces lamelles sont alignées et empilées régulièrement, principalement parallèlement les unes aux autres avec un changement de direction des fibrilles entre deux lamelles adjacentes. Cependant, cette organisation hiérarchique anisotrope de la cornée et ses conséquences physiologiques sur la biomécanique de la cornée sont encore mal caractérisées en raison des limitations des techniques d’imagerie conventionnelles. La microscopie par génération de second harmonique (SHG) est aujourd'hui la technique de référence pour la visualisation in situ de l'organisation tridimensionnelle (3D) du collagène dans les tissus biologiques non colorés. Les mesures résolues en polarisation (P-SHG) fournissent des informations complémentaires sur l'organisation hiérarchique du collagène dans le volume focal : principalement l'orientation moyenne des fibrilles de collagène et leur distribution d'orientation. La microscopie SHG a déjà été utilisée sur la cornée par divers groupes, dont le nôtre qui a publié les premières images multiphoton multimodales de la cornée humaine, les premières images multiphoton in vivo de la cornée de rat et les premières images P-SHG de la réorganisation du stroma à pression croissante. Ce projet a pour but principal d’obtenir un atlas de la structure 3D de la cornée allant de l'échelle nanométrique (fibrilles de collagène) à l'échelle centimétrique (taille de la cornée entière). Cet atlas sera obtenu par microscopie SHG, en utilisant des images résolues en polarisation pour visualiser la structure submicrométrique des lamelles de collagène, à savoir l'orientation et le degré d'alignement des fibrilles de collagène. Des outils d’analyse d’image quantitative seront développés afin de caractériser complètement l'organisation du stroma (antérieur versus postérieur, centre versus périphérie, etc....) et d'identifier les structures pertinentes pour les propriétés mécaniques et réfractives de la cornée. Cet atlas quantitatif sera établi dans des cornées saines en conditions physiologiques pour servir de référence. Des cornées pathologiques (principalement des kératocônes) seront ensuite caractérisées de la même manière pour identifier les différences de structure et permettre à la fois une caractérisation fondamentale et le diagnostic de ces pathologies. Enfin, une cartographie SHG similaire sera réalisée en augmentant la pression intraoculaire pour élucider les relations entre la structure multi-échelle et les propriétés mécaniques de la cornée.

The cornea is a unique tissue featuring several important physiological properties, mainly transparency and refraction, related to crucial biomechanical properties. All these properties are closely related to the structure of stroma, which consists of 1-3 µm thick stacked lamellae made of collagen fibrils (25-30 mm of diameter). These lamellae are aligned and regularly packed, mainly parallel to each other with a change in direction of fibrils between two adjacent lamellae. However, this anisotropic hierarchical organization of the cornea and its physiological consequences on cornea biomechanics have been poorly characterized yet because of the limitations of conventional techniques. Second Harmonic Generation (SHG) microscopy is nowadays the gold standard for in situ visualization of collagen three-dimensional (3D) organization in unstained biological tissues. Polarization-resolved measurements (P-SHG) further provide complementary information about the hierarchical organization of collagen within the focal volume: mainly the mean orientation of collagen fibrils, and the fibril orientation distribution. SHG microscopy has already been used in cornea by various groups, including our group who published the first multimodal multiphoton images of human cornea, the first in vivo multiphoton images of rat cornea and the first P-SHG images of stroma reorganization at increasing pressure. This project first aims to set up an atlas of the 3D structure of the Human cornea from the nanometer scale (collagen fibrils) to the centimeter scale (full size of the cornea). This atlas will be recorded using SHG microscopy, including polarization resolution to visualize the sub-micrometer lamellae structure, namely the orientation and degree of alignment of collagen fibrils. Quantitative image processing tools will be developed to fully characterize the stromal organization (anterior versus posterior, center versus periphery, etc ) and to identify stromal structures that are relevant for cornea mechanical and refractive properties. This quantitative atlas will be established in healthy corneas and in physiological conditions to serve as a reference. Pathological corneas (mainly keratoconus) will then be characterized the same way to identify structural differences relevant for the fundamental characterization and the diagnosis of these pathologies. Finally, similar SHG mapping will be performed at increasing intra-ocular pressure to decipher the relationship between the multi-scale structure and the mechanical properties of the cornea.