Intégration de la préparation des échantillons dans une analyse par spectrométrie de masse et PCR isotherme

Simplified sample preparation for analysis by mass spectrometry and isothermal PCR

• Auteur / Autrice : Lilas Pommies
• Direction : Hervé Volland
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 11/01/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Médicaments et technologies pour la santé (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Santé et médicament (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Bernard Maillère
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Franck Molina, Vincent Cattoir, Samar Issa, Clara Ballesté-Delpierre, Sébastien Quesney
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Franck Molina, Vincent Cattoir

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN -- Amplification

PCR (génétique)

Spectrométrie de masse

Résistance aux antibiotiques

Mots clés libres

Pcr isotherme

Préparation échantillon

Détection

Antibiorésistance

Spectrométrie de masse

Isothermal pcr

Mass spectrometry

Detection

Sample processing

Antimicrobial resistance

Résumé

La bio-analyse correspond à l'identification et la quantification des molécules biologiques ou activement biologiques dans un échantillon. Elle se divise en plusieurs étapes : la collecte de l'échantillon et l'envoi au laboratoire ; la préparation des échantillons qui permet de le rendre compatible à la méthode d'analyse ; l'analyse et enfin la mesure des événements ayant eu lieu pendant l'analyse.Au cours de cette thèse, deux types d'analyse ont été étudiées : la spectrométrie de masse, plus particulièrement le MALDI-TOF, et une PCR isotherme nommée amplification isotherme médiée par les boucles (LAMP).L'objectif principale de la thèse était de rendre compatible ces méthodes d'analyse à une utilisation terrain. Pour cela, le SPID, un dispositif breveté par le CEA, a été adapté à ces deux technologies. Ce dispositif permet la filtration, la concentration, l'extraction d'une suspension bactérienne et la détection par immunochromatographie à flux latéral. Le SPID est un outil qui permet de s'affranchir des étapes de centrifugations ou lavages, méthodes classiquement utilisées pour préparer les échantillons pour le MALDI et la LAMP.Pour extraire les protéines ribosomales, pour une analyse au MALDI-TOF, il a fallu développer un tampon d'extraction compatible avec une telle analyse. En effet, pour faciliter la lyse bactérienne, l'utilisation de détergents est souvent recommandée ; or, les détergents peuvent empêcher l'identification des bactéries en spectrométrie de masse. Les résultats ont été comparés avec un protocole de référence proposé par Bruker. L'utilisation du SPID a permis d'identifier trois espèces bactériennes à une concentration de 107 UFC/mL dans un milieu simple et en urine. Le protocole de référence, quant à lui, a permis ces mêmes identifications à une concentration de 106 UFC/mL.Pour extraire l'ADN des bactéries avec le SPID suivi d'une amplification LAMP, de nombreuses mises au point ont été faites. Après avoir implanté la technique au laboratoire, différentes méthodes d'extraction avec le SPID ont été développées. Celle qui permet d'obtenir les meilleurs résultats est la création d'un tampon d'extraction combiné aux réactifs nécessaires à la LAMP. L'autre méthode étudiée est l'utilisation de billes de silice pour purifier l'ADN avant la réaction d'amplification.Pour rendre le chauffage compatible à une utilisation terrain, une station de chauffage a été conçue au cours de la thèse. Cette station permet de chauffer le réservoir du SPID pendant 40 minutes à 65 °C. Elle pourrait être alimentée par batterie.La détection des produits de l'amplification, appelés amplicons, est faite par immunochromatographie à flux latéral. Les amplicons sont marqués à leurs extrémités grâce à deux amorces. Une des amorces est marquée à la digoxigénine, l'autre à la biotine. L'amplicon est capturé par un anti-anticorps anti-digoxigénine, immobilisé sur une membrane de nitrocellulose, et est révélé à l'aide de la streptavidine couplé à des nanoparticules d'or.Avec les différents éléments développés au cours de cette thèse, le protocole pour réaliser une LAMP sur le terrain dure moins d'une heure : de la préparation des échantillons à la détection.

Bioanalysis is the identification and the quantification of biological molecules or active biological agent in a sample. It is divided into several stages: sample collection and sending to the laboratory; sample preparation to make it compatible with the analysis method; analysis and, finally, measurement of the events occurring during the analysis.During this thesis, two analysis were studied: mass spectrometry, more specifically MALDI-TOF and an isothermal PCR called Loop-mediated isothermal amplification (LAMP).The main aim was to make these methods compatible with field use. To achieve this, the SPID, a device patented by CEA, was adapted to both technologies. This device enables a bacterial suspension to be filtered, concentrated, extracted and detected by lateral flow immunoassay. The SPID is a tool that eliminate the need for centrifugation or washing, methods traditionally used to prepare sample for MALDI and LAMP.To analyze ribosomal proteins by MALDI-TOF, an extraction buffer compatible with this technic had to be developed. Indeed, to facilitate bacterial lysis, the use of detergents is often recommended but detergents can prevent the identification of bacteria by mass spectrometry. The results were compared with a reference protocol proposed by Bruker. Using SPID, three bacterial species were identified at a concentration of 107 CFU/mL in a simple medium and in urine. In contrast, the reference protocol identified the same species at a concentration of 106 CFU/mL.To make heating step compatible with filed use, an autonomous heating station was designed during the thesis. This station heats the SPID tank for 40 minutes at 65°C. It could be battery-powered.The amplification products, called amplicons, are detected by lateral flow immunoassay. Amplicons are end-labeled using two pirmers. One primer is labeled with digoxygenin, the other with biotin. The amplicon is captured by an anti-digoxigenin antibody, immobilized on a nitrocellulose membrane; and revealed using streptavidin coupled to gold nanoparticles.With the optimizations made during the thesis, the complete LAMP field protocol takes less than an hour : from de sample preparation to the detection.