Synthèse de nanoparticules hybrides pour cibler les vésicules extracellulaires ou les récepteurs de mort cellulaires et déploiement d'outils analytiques biophysiques

Synthesis of hybrid nanoparticles to target extracellular vesicles or cells death receptors and deployment of biophysical analytical tools

• Auteur / Autrice : Mélanie Romain
• Direction : Nadine Millot, Wilfrid Boireau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 19/12/2023
• Etablissement(s) : Bourgogne Franche-Comté
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Carnot-Pasteur (Besançon ; Dijon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de préparation : Université de Bourgogne (1970-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Interdisciplinaire Carnot de Bourgogne (ICB) (Dijon)
• Jury : Président / Présidente : Étienne Duguet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Valérie Marchi, Olivier Micheau
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Élodie Boisselier Mailfait, Carole Chaix

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vésicules extracellulaires

TNF (cytokines)

Vésicules extracellulaires

Nanoparticules

Mots clés libres

Nanoparticules

Propritétés plasmoniques

Vésicules extracellulaires

Fonctionnalisation

Biopuce

Diagnostique/Thérapeutique

Nanoparticles

Plasmonic properties

Extracellular vesicles

Functionalization

Biochip

Diagnosis/Therapy

Résumé

Les vésicules extracellulaires (EVs) suscitent un intérêt croissant en raison de leur capacité à transporter du contenu biologique pendant la communication intercellulaire et de leur libération notable dans les biofluides, ce qui en fait des biomarqueurs prometteurs pour les applications théranostiques. Cependant, il est très difficile de les cibler, de les isoler ou de les caractériser spécifiquement car leur circulation se fait dans des échantillons complexes (sang...) contenant toutes les sous-classes d'EVs libérées continuellement par les cellules de différents tissus/fluides. Les sous-populations d'intérêt y sont mineures et difficiles à atteindre. Le projet NPs@EVs vise à séparer les sous-populations d'EVs grâce à un dispositif acoustofluidique permettant d'aligner et de trier efficacement des particules biologiques submicroniques en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. Afin d'affiner le tri, les EVs ciblées seront dopées par des nanoparticules hybrides (NPs), facilitant ainsi la caractérisation des EVs. Les NPs d'oxyde de fer superparamagnétique (SPIONs) et les NPs d'or (AuNPs) ont été choisies à cette fin, en raison de leurs propriétés magnétiques et plasmoniques respectivement. La synthèse des NPs est réalisée de manière à obtenir des tailles comparables pour les deux matériaux différents, afin d'étudier leur influence sur l'application finale. Une première étape de greffage de ligands est réalisée, conduisant à des suspensions stables, avec différents ligands choisis pour assurer des chimies externes identiques, et comparer l'influence finale de la longueur du ligand. Des études par spectroscopie UV-visible et par SPR permettent de définir les conditions optimales de greffage pour cette étape, mais aussi de comprendre certaines caractéristiques des couches de ligands finales. Les NPs doivent ensuite être biofonctionnalisées en fonction des biomarqueurs d'intérêts pour cibler les microparticules polymères biomimétiques utilisées comme EVs modèles, et fonctionnalisées avec de l'ovalbumine. La biofonctionnalisation des NPs est d'abord réalisée avec le cytochrome C choisi pour définir les conditions de greffage, puis l'anticorps anti-ovalbumine. Le SPRi a ensuite été utilisé pour évaluer la capacité de ciblage des NPs biofonctionnalisées, et montre une bonne reconnaissance des anticorps greffés à la surface d'un antigène. Des tests préliminaires ont été effectués pour étudier l'attachement sélectif des NPs hybrides à des microparticules biomimétiques. Ils montrent que certaines NPs ont été greffées avec succès, mais que la procédure de séparation doit être optimisée en raison de la quantité de NPs libres restantes. Les prochaines étapes devraient se concentrer sur l'amélioration des protocoles de ciblage et leur application sur des échantillons d'EVs, avant les tests d'application du dispositif acoustofluidique.Un autre projet s'est concentré sur l'utilisation de NPs hybrides pour l'immunothérapie, en utilisant des biomolécules ciblant les récepteurs de mort de la superfamille de nécrose tumorale, couplées à l'hyperthermie. Pour obtenir des propriétés plasmoniques compatibles avec les procédures de stimulation classiques pour la photothérapie, des nanorods d'or (AuNRs) ont été synthétisés. Des PEG hétérobifonctionnels ont été utilisés pour leur fonctionnalisation afin de stabiliser les AuNRs et de se débarrasser du surfactant cytotoxique utilisé lors de la synthèse des NRs. Différentes stratégies de couplage, dont l'EDC/NHS, la formation d'une base de Schiff après oxydation de l'anticorps et la click chemistry, ont ensuite été évaluées pour greffer des biomolécules aux AuNRs et comparer l'efficacité finale de l'immunothérapie. La click chemistry a permis de maximiser les effets pro-apoptotiques. Une optimisation de la formulation est nécessaire pour utiliser ces nanoplateformes dans le cadre d'études in vivo

Extracellular vesicles (EVs) present a growing field of interest due to their ability for biological content transport during intercellular communication and their noteworthy release in biofluids, making them promising biomakers for theranostic applications. However, it is very difficult to specifically target, isolate or characterize them because their circulation happens in complex samples (blood…) containing all subclass of EVs released continuously from different tissue/fluid cells. There, sub-populations of interests are minor and difficult to reach. The project NPs@EVs aims to separate EVs sub-populations thanks to an acoustofluidic device to efficiently align and sort submicron biological particles based on their physico-chemical properties. In order to refine the sorting, targeted EVs will be spiked by hybrid nanoparticles (NPs), thus also facilitating EVs characterization. Superparamagnetic iron oxide NPs (SPIONs) and gold NPs (AuNPs) are chosen for this purpose, owing to their magnetic and plasmonic properties respectively. The synthesis of the NPs is achieved to get comparable sizes for the two different materials, to study this influence on final application. A first ligand grafting step is carried out, leading to stable suspensions, with different ligands chosen to ensure identical external chemistries, and compare the final influence of ligand length. Studies with UV-visible spectroscopy and SPR assays enable to define the optimum grafting conditions for this step, but also to understand some characteristics of the final ligand layers. NPs must then be biofunctionalized depending on the biomarkers of interests to target biomimetic polymer microparticles used as model EVs and functionalized with ovalbumin. The biofunctionalization of NPs is initially carried out with cytochrome C chosen to define grafting conditions, and then ovalbumin antibody. SPRi was then used to assess the targeting ability of the biofunctionalized NPs, and show a good recognition of the grafted antibodies to an antigen surface. Preliminary tests were carried out to study selective attachment of the hybrid NPs to biomimetic microparticles. They show successful grafting of some particles, but separation procedure must be optimized owing to the amount of remaining free NPs. Next steps should focus on improvement of targeting protocols and their application on EVs samples, before tests in application of the acoustofluidic device.Another project focused on the use of hybrid NPs for immunotherapy, using biomolecules targeting death receptors of the tumor necrosis superfamily, coupled with hyperthermia. To get compatible plasmonic properties with classical stimulation procedures for phototherapy, gold nanorods (AuNRs) were synthetized. Heterobifunctional PEG were used for their functionalization to stabilize the AuNRs and get rid of cytotoxic surfactant used during the NRs synthesis. Different coupling strategies, including EDC/NHS, Schiff base formation after antibody oxidation and click chemistry, were then assessed to graft biomolecules to the AuNRs, and compare final immunotherapy efficiency. Click chemistry offered the maximized pro-apoptotic effects. Optimization are required on the formulation to use those nanoplatforms for in vivo studies.