Activation du canal potassique TREK-1 par les acides gras poly-insaturés

TREK-1 activation by polyunsaturated fatty acids

• Auteur / Autrice : Emilie Bechard-drimaracci
• Direction : Marie Demion, Jean-Yves Le Guennec
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 23/10/2023
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : PhyMedExp - Physiologie et Médecine Expérimentale du Coeur et des Muscles
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : 1. Dynamiques des couplages cardiaques
• Jury : Président / Présidente : Anne-Alienor Very
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie Demion, Bruno Allard, Sébastien Roger, Jean-Yves Le guennec, Olga Andrini
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Bruno Allard, Sébastien Roger

Mots clés

Mots clés libres

Trek-1

Canaux ioniques

Acides gras

Membrane

Mécano-sensible

Trek-1

Ionic channels

Fatty acids

Membrane

Mecanosensitive

Résumé

La famille des canaux potassiques est la plus large et diversifiée. On retrouve entre-autre les canaux Kv dépendants du voltage, les canaux Kir à rectification entrante et les canaux K2P à deux domaines pores. Le canal TREK-1 appartient à la famille de canaux potassiques de fonds K2P et présente un courant à rectification sortante. Son activité est régulée par divers stimuli physiques ou chimiques comme la pression, le voltage, les modifications du pH, des agents pharmacologiques ou encore les acides gras poly-insaturés (AGPIs). Cette riche modulation par son environnement lui permet de participer à la régulation adaptée de l’excitabilité des cellules. Sa poly-modulation fait de TREK-1 une cible pharmacologique de choix dans les pathologies de la dépression, de l’hyperexcitabilité neuronale comme l’épilepsie ou encore des troubles du rythme cardiaque. Ma thèse s’intéresse à la régulation de l’activité du canal TREK-1 par les acides gras poly-insaturés. Les AGPIs sont des composants de la membrane cellulaire qui sépare le milieu intérieur du milieu extracellulaire. Ils présentent d’autres rôles physiologiques ; l’acide arachidonique et l’acide eicosapentaénoïque (EPA) sont les précurseurs de molécules impliquées dans les processus inflammatoires. Les AGPIs de type Oméga-3 présentent des propriétés bénéfiques neuro- et cardio-protectrices. L’EPA et le DHA (acide docosahexaénoïque), deux Oméga-3, présentent des propriétés antiarythmiques via la modulation de l’activité des canaux ioniques sodiques, calciques et potassiques impliqués dans toutes les phases du potentiel d’action. L’objectif de ma thèse est d’améliorer notre compréhension du mécanisme d’action des AGPIs dans l’activation de TREK-1. Grâce à la technique de patch-clamp en configurations cellule-entière et inside-out, nous avons étudié dans des modèles de surexpressions stables et transitoires du canal TREK-1 WT et du mutant G171D, l’activation de TREK-1 par des acides gras saturé, monoinsaturé, poly-insaturés et un activateur direct, le ML402. La réversibilité immédiate et totale de l’effet des AGPIs sur TREK-1 nous a menée à reconsidérer l’hypothèse selon laquelle ils activeraient TREK-1 via une voie mécano-sensible, en modifiant les propriétés de la membrane (fluidité et courbure) suite à leur insertion. L’étude des cinétiques des effets des AGPIs et du ML402 montrent qu’ils se comportent comme des activateurs directs du canal, suggérant l’existence d’au moins un site d’interaction des AGPIs avec TREK-1. L’accessibilité de ce site par les faces interne et externe, au travers de la membrane est favorisée par les propriétés hydrophobes de la chaîne aliphatique des AGPIs expliquant leur effet en configurations cellule-entière et inside-out. L’estérification du domaine carboxylique et la conjugaison des insaturations des AGPIs prévient leur effet. Ces résultats suggèrent que les AGPIs interagissent avec TREK-1 en formant des liaisons électrostatiques et/ou hydrogènes via leur extrémité carboxylique tandis que le volume occupé par la chaîne aliphatique facilite ou non leur accès au site de liaison. L’étude du courant TREK-1 induit par des steps dépolarisants montre que le courant présente une composante instantanée, résultat du changement de gradient-électrochimique, et une composante temps-dépendante, conséquence d’une dépendance au voltage. Au cours de son activation par les AGPIs, la composante temps-dépendante est convertie en composante instantanée et la rectification sortante du courant est perdue. Cette perte de la dépendance au voltage reflète le basculement de TREK-1 d’un mode voltage-dépendant à un mode « leaky ». La mutation gain de fonction G171D abolie la rectification sortante de TREK-1 et prévient l’activation par les AGPIs. Ainsi nous proposons que l’interaction directe des AGPIs avec le canal TREK-1 permet son activation en le rendant indépendant du voltage dans toute la gamme de potentiel, faisant de lui un canal de fuite idéal.

The potassium channel family is the largest and the most diversified in the animal kingdom. Among the potassium channels, there is voltage-dependent Kv channels, the inwardly rectifying Kir channels and the background potassic K2P channels with two pore-domains. TREK-1 channel belongs to the K2P family of background potassium channels and displays an outwardly rectification. Its activity is poly-modulated by a large range of physical and chemical stimuli such as pressure, voltage, pH modifications, pharmacologic agents and polyunsaturated fatty acids (PUFAs). This large modulation by its environment enables it to participate in the adapted regulation of the cellular excitability. Its poly-modulation makes it a target of choice for pharmacological molecules in the physiopathology of depression, seizure or cardiac arrythmias. My thesis focuses on the activation of TREK-1 by PUFAs. PUFAs are membrane components that separate the intra- from the extra-cellular medium. PUFAs have other physiological roles; for instance, arachidonic acid and eicosapentaneoic acid (EPA) are the precursors of inflammatory molecules. Omega-3 PUFAs display benefic neuro- and cardio-protective properties. EPA and DHA (docosahexaenoic acid), have antiarrhythmic properties through the modulation of ionic channels activities involved in every phase of the action potential. The aim of my thesis is to improve our understanding of the mechanism of action of PUFAs in the TREK-1 activation. Thanks to the patch-clamp technique in both whole-cell and inside-out configurations, we studied the TREK-1 activation by saturated, monounsaturated, polyunsaturated fatty acids and by a direct activator, ML402. We worked in cellular models of HEK that stably overexpressed TREK-1 or in a model of HEK cells transiently transfected with WT TREK-1 or with the G171D mutant of TREK-1 channel. The immediate and total reversibility of the PUFAs effects on TREK-1 led us to rethink the assumption that PUFAs activation of TREK-1 involved a mechanosensitive pathway in which PUFAs insert into the membrane modifying its biophysical properties (fluidity or curvature). The study of the kinetics PUFAs and ML402 effects show that PUFAs behave like direct activators of TREK-1. This observation suggests that there is at least one binding site for PUFAs on TREK-1 channel. The activation of TREK-1 in both whole-cell and inside-out configuration suggests that the binding sit is accessible from the inner and outer leaflet of the membrane. This double accessibility through the membrane would be allowed by the hydrophobic properties of the aliphatic chain of PUFAs. The esterification of the carboxyl extremity and the conjugation of PUFAs (configuration Cis to Trans) prevent TREK-1 activation. These results suggest that PUFAs bind to TREK-1 with their carboxyl extremity, by forming electrostatic and/or hydrogen interactions and that the volume occupied by the aliphatic chain facilitates, or not, their accessibility to the binding site. The study of the TREK-1 current elicited by depolarizing steps shows that TREK-1 current displays two components: an instantaneous component resulting from the alteration of the driving-force and a second time-dependent component characteristic of a voltage-dependence of the channel. The activation of TREK-1 channel by PUFAs shifts the time-dependent component into an instantaneous component and the outwardly rectification of the current-voltage relation is lost. This loss of voltage-dependent feature reflects the shift from a voltage-dependent mode to a leak mode. The G171D gain-of-function mutation of TREK-1 abolished the outwardly rectification of TREK-1 current and prevents TREK-1 activation by PUFAs. Hence, we suggest that PUFAs binding on TREK-1 allows the TREK-1 activation through a switch from the voltage-dependent mode to the leak mode where TREK-1 is fully opened for all voltages. Thus, TREK-1 channel is converted into a perfect leak channel by PUFAs.