Étude de l'interaction des synthases de cyclodipeptides avec leurs substrats ARNt-aminoacylés par RMN et cristallographie aux rayons X.

par Fatima zahra Marouf

Projet de thèse en Biochimie et biologie structurale

Thèses en préparation à université Paris-Saclay , dans le cadre de École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Institut de Chimie des Substances Naturelles (laboratoire) et de Faculté de pharmacie (référent) depuis le 01-10-2020 .


  • Résumé

    Les synthases de cyclodipeptides (CDPS) produisent des cyclodipeptides et des dérivés complexes, les dicétopipérazines (DKP) qui constituent une large classe de produits naturels synthétisés par des micro-organismes et possédant des propriétés pharmacologiques remarquables telles qu'antibactériennes, antivirales ou anticancéreuses. Les CDPS sont des enzymes de petite taille (200-300 résidus) qui détournent les ARNt aminoacylés (AA-ARNt) de la voie de synthèse peptidique canonique au profit du métabolisme spécialisé. La plupart des CDPS ont une spécificité relâchée et produisent souvent un cyclodipeptide composé de deux acides aminés identiques. Ceci entrave la discrimination des deux sites de liaison des entités ARNt, l'étude cinétique et l'identification des déterminants de spécificité. Pour surmonter ce problème, on a orienté les travaux sur un membre de la sous-famille XYP, Nbra-CDPS qui a l'avantage d'utiliser deux substrats différents, l'Alanyl-ARNt(Ala) et le Glutamyl-ARNt(Glu) pour la première et la deuxième poche respectivement, synthétisant ainsi le cAE comme produit principal. Une limitation a été rencontrée lors de l'étude cristallographique des complexes CDPS:AA-ARNt, les cristaux obtenus diffractent à une résolution de 5 Å. D'autre part, une étude récente réalisée dans l'équipe de Muriel Gondry montre que les bras accepteurs des ARNt (AA-microHx) sont d'aussi bons substrats que les AA-ARNt complets. Afin d'étudier la région minimale de l'ARNt nécessaire à l'interaction, une stratégie utilisant les flexizymes (Fx) a été mise en place. Les Fx sont des ribozymes de 45 à 47 nucléotides. Polyvalents, ils interagissent avec seulement trois nucléotides conservés des ARNt : N73C74C75 et catalysent l'aminoacylation in vitro de divers ARNt raccourcis en utilisant des acides aminés (ou leurs analogues non canoniques) chimiquement activés. Une étude au laboratoire a permis d'utiliser les Fx pour produire le Glutamyl-microHx(Glu) et l'Alanyl-microHx(Ala), à partir de séquences du bras accepteur de longueur variable. Les résultats des tests enzymatiques ont démontré que les microhélices contenant sept paires de bases sont utilisées par Nbra-CDPS avec autant d'efficacité catalytique que les substrats naturels. L'utilisation de ces substrats raccourcis serait donc plus favorable à l'étude structurale des complexes par cristallographie et RMN. La thèse se déroulera dans trois laboratoires partenaires dans le cadre d'un projet transdisciplinaire et collaboratif porté par Muriel Gondry (LBPEG, I2BC). L'objectif du projet de thèse est de comprendre le fonctionnement des CDPS et d'identifier les résidus de ces enzymes responsables de la spécificité du substrat. La substitution de ces résidus par génie enzymatique permettra d'obtenir des enzymes pouvant utiliser de nouveaux substrats comportant des acides aminés non canoniques afin de produire, par un processus de biosynthèse écologique, différents DKP à fort potentiel thérapeutique. Les meilleures conditions de solubilisation des CDPS seront déterminées en partenariat avec Eric Jacquet, responsable de la plateforme de PCR quantitative haut débit de l'ICSN. La RMN permettra de cartographier sur la protéine les zones d'interaction avec les AA-microHx sous la direction de Nelly Morellet et Ewen Lescop (CBSA, ICSN). La cristallographie au rayons X sera utilisée sous la direction de Jean-Baptiste Charbonnier (LBSR, I2BC) pour l'obtention de la structure des complexes CDPS:AA-microHx lorsque cela sera possible.

  • Titre traduit

    Deciphering the interactions of Cyclodipeptide Synthases with their aminoacyl-tRNA substrates by NMR and X-ray crystallography.


  • Résumé

    Cyclodipeptide synthases (CDPS) produce cyclodipeptides and complex derivatives, diketopiperazines (DKP), which constitute a broad class of natural products synthesized by microorganisms and possessing remarkable pharmacological properties such as antibacterial, antiviral or anticancer. CDPS are small enzymes (200-300 residues) that divert aminoacyl-tRNAs (AA-tRNAs) from their canonical role in protein synthesis by ribosomes to secondary metabolism. Most CDPS have a relaxed specificity. They often produce a cyclodipeptide composed of two identical amino acids. This hinders the discrimination of the two binding sites of tRNA entities, the kinetic study and the identification of specificity determinants. To overcome this problem, work has focused on a member of the XYP subfamily, Nbra-CDPS, which has the advantage of using two different substrates, Alanyl-tRNA(Ala) and Glutamyl-tRNA(Glu) for the first and second pocket respectively, thus synthesizing cAE as the main product. A crystalline form containing CDPS:AA-ARNt complex was obtained. Because crystals diffracted to 5 Å resolution, the quality of the electron density does not provide an atomic model for the complexe. Moreover, a recent study by Muriel Gondry's team shows that CDPS interact mainly with the acceptor arms of tRNAs (AA-microHx). In order to study the minimal region of tRNA required for interaction, a strategy using flexizymes (Fx) was implemented. Fx are ribozymes of 45 to 47 nucleotides. Versatile, they interact with only three conserved tRNA nucleotides: N73C74C75 and catalyze the in vitro aminoacylation of various shortened tRNAs using a near infinite range of chemically-activated amino acids or surrogates as substrates. In a laboratory study, Fx was used to produce Glutamyl-microHx(Glu) and Alanyl-microHx(Ala) from acceptor arm sequences of variable length. Enzyme test results showed that microhelices containing seven base pairs are used by Nbra-CDPS with as much catalytic efficiency as natural substrates. Thus, these shortened substrates will be used for structural studies. The objective of this project is to understand the functioning of these enzymes and to identify the CDPS residues responsible for substrate specificity. The substitution of these residues by enzymatic engineering will make it possible to obtain enzymes that can use new substrates such as noncanonical amino acids. The objective is to produce, through an ecological biosynthesis process, different DKPs with high therapeutic potential. It is a project led by Muriel Gondry (LBPEG, I2BC) in partnership with Jean-Baptiste Charbonnier for the X-ray crystallography part (LBSR, I2BC), Nelly Morellet and Ewen Lescop (CBSA, ICSN) for the NMR part and Eric Jacquet in charge of the high throughput quantitative PCR platform (ICSN). The thesis will take place in the three laboratories presented above. In a first step, the PhD student will have to produce CDPS proteins, enriched (NMR studies) or not (crystallization tests) in 15N and 15N-13C and 15N-13C-2D, by overexpression in Escherichia Coli. It will then be necessary to find the best solution conditions using thermal shift assays that quantify the change in thermal denaturation temperature of a protein under different conditions of pH, salt concentrations, type of buffers and additives (glycerol ...). In a second step, the PhD student will have to identify the minimum tRNA sequence necessary for the interaction of CDPS:AA-microHx complexes. And finally the PhD student will have to characterize the CDPS residues responsible for the specificity of the substrate, either by NMR or by obtaining structures by X-ray crystallography of CDPS:AA-microHx complexes when possible.