Rôle de la SUMOylation de Cin8 et de Ase1 dans l’organisation de la midzone du fuseau mitotique

Role of Cin8 and Ase1 SUMOylation in the organization of the mitotic spindle midzone.

• Auteur / Autrice : Paul Lambey
• Direction : Dimitris Liakopoulos
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 02/12/2024
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : CRBM - Centre de Recherche en Biologie cellulaire de Montpellier
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Détermination de la position du fuseau mitotique et du plan de clivage cellulaire
• Jury : Président / Présidente : Guillaume Bossis
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Dimitris Liakopoulos, Isabelle Arnal, Anthi Karaiskou, Cécile Boscheron, Didier Portran
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Isabelle Arnal, Anthi Karaiskou

Mots clés

Mots clés libres

Division Cellulaire

Microtubules

Moteur Moléculaire

SUMOylation

Microscopie Tirf

Biochimie

Cell Division

Microtubules

Molecular Motor

SUMOylation

TIRF Microscopy

Biochemistry

Résumé

La division cellulaire est un mécanisme fondamental par lequel l'information génétique est répliquée puis répartie physiquement et équitablement entre deux cellules filles. Cette phase de ségrégation, appelée mitose, est caractérisée par l'organisation d'une structure appelée fuseau mitotique, qui est responsable de la répartition correcte des chromosomes à l'intérieur de la cellule. La kinésine-5 (Cin8 chez S. cerevisiae) et la protéine PRC1 (Ase1 chez S. cerevisiae). PRC1/Ase1 sont deux protéines hautement conservées qui jouent un rôle majeur dans l'organisation du fuseau, en stabilisant la zone de microtubules (MT) antiparallèles entre les deux pôles du fuseau (midzone). PRC1/Ase1 est un hétérodimère qui se lie aux MTs antiparallèles, ce qui permet la formation et la stabilisation de la zone médiane du fuseau (Braun et al., 2011). La kinesin-5/Cin8 est un homo-tétramère avec deux paires de domaines moteurs, qui permettent aux MTs de glisser l'un par rapport à l'autre, facilitant l'élongation du fuseau et la ségrégation des chromosomes (Hildebrandt et al., 2006). Ma thèse étudie l'effet de la SUMOylation, une modification des protéines de type ubiquitine, sur l'interaction entre Ase1 et Cin8. Afin d'étudier le rôle de la SUMOylation sur Ase1 et Cin8, j'ai suivi une approche à différentes échelles : 1) au niveau cellulaire, en générant des lignées de levure dans lesquelles l'expression de Ase1, Cin8 et/ou Smt3 (SUMO) a été modifiée pour évaluer l'implication de la SUMOylation dans l'organisation de la zone médiane du fuseau ; 2) au niveau protéique, en analysant l'effet de cette modification sur l'activité des protéines Ase1 et Cin8 à l'aide de techniques de reconstitution in vitro. Les résultats suggèrent que la SUMOylation est impliquée dans l'organisation de la zone médiane du fuseau car sa perte conduit à un allongement excessif du fuseau mitotique, à une réduction de la localisation de Cin8 sur la zone médiane, ainsi qu’une désorganisation de Ase1 et donc de la zone médiane. En utilisant des expériences de co-immunoprécipitation, j'ai confirmé que l'interaction entre Ase1 et Cin8 est réduite dans les mutants de levures qui présentent de faibles niveaux de SUMOylation. Cependant, des observations in vitro utilisant une version chimérique d'Ase1 en fusion avec SUMO n'ont montré aucune différence ni dans l'interaction avec Cin8 ni dans l'interaction d'Ase1 avec les MTs. La SUMOylation de plusieurs protéines dans le même complexe a le potentiel de stabiliser les interactions entre les membres du groupe (SUMOylation de groupe). Mes résultats révèlent donc la possibilité que l'interaction entre Cin8 et Ase1 ne nécessite pas seulement la SUMOylation de ces deux protéines mais soit stabilisée par les SUMOylations multiples d'un groupe de facteurs de la zone médiane.

Cell division is a fundamental mechanism by which genetic information is replicated and then physically and equitably distributed between two daughter cells. This segregation phase, called mitosis, is characterized by the organization of a structure called the mitotic spindle, which is responsible for the correct partitioning of chromosomes within the cell. The kinesin-5 (Cin8 in S. cerevisiae) and the PRC1 protein (Ase1 in S. cerevisiae). PRC1/Ase1 are two highly conserved proteins that play a major role in spindle organization, by stabilizing the zone of antiparallel microtubules (MTs) between the two spindle poles (midzone). PRC1/Ase1 is a heterodimer that binds antiparallel MTs, which enables the formation and stabilization of the midzone (Braun et al., 2011). Kinesin-5/Cin8 is a homo-tetramer with two pairs of motor domains, which allow MTs to slide relative to one another, facilitating spindle elongation and chromosome segregation (Hildebrandt et al., 2006). My thesis investigates the effect of SUMOylation, a ubiquitin-like protein modification, on the interaction of Ase1 and Cin8. In order to further study the role of SUMOylation on Ase1 and Cin8, I followed an approach at different scales: 1) at the cellular level, generating yeast lines in which the expression of Ase1, Cin8 and/or Smt3 (SUMO) was modified to assess the involvement of SUMOylation in the spindle midzone organization; 2) at the protein level, by analyzing the effect of this modification on the activity of the Ase1 and Cin8 proteins using in vitro reconstitution techniques. The results suggest that SUMOylation is involved in the organization of the spindle midzone as its loss leads to over-elongation of the spindle, reduction of Cin8 localization on the midzone, as well as midzone and Ase1 disorganization. Using co-immunoprecipitation experiments, I confirmed that the interaction between Ase1 and Cin8 is reduced in yeast mutants that display low SUMOylation levels. However, in vitro observations using a chimeric version of Ase1 in fusion with SUMO showed no difference neither in the interaction with Cin8 nor in Ase1’s interaction with MTs. SUMOylation of multiple proteins in the same complex has the potential to stabilize the interactions between the group members (group SUMOylation). My results raise thus the possibility that the interaction between Cin8 and Ase1 requires not only SUMOylation of these two proteins but is stabilized through the multiple SUMOylations of a group of midzone factors.