Caractérisation d’un nouveau mécanisme de restriction du VIH-1 dans les cellules de Langerhans humaines

Characterization of a new HIV restriction mechanism in human Langerhans cells

• Auteur / Autrice : Quentin Hertel
• Direction : Fabien Blanchet
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 06/03/2024
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IRIM - Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Trafic Viral, Restriction et Immunité Innée
• Jury : Président / Présidente : Jean-Christophe Paillart
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yonatan Ganor, Sabrina Brechard, Fabien Blanchet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Yonatan Ganor, Sabrina Brechard

Mots clés

Mots clés libres

S100a9

Immunité intrinsèque

Vih

Trafficking intracellulaire

Cellules de Langerhans

Hiv

Intrinsic Immunity

Intracellular trafficking

Langerhans cells

S100a9

Résumé

Les alarmines sont des médiateurs sécrétés passivement ou activement dans le milieu extracellulaire et qui agissent comme des signaux de dangers pour les cellules environnantes, leur permettant ainsi d’initier une réponse inflammatoire et immunitaire adaptée en cas de dommages cellulaires ou d’infections. Parmi elles, la protéine chélatrice de cations divalents S100A9 et son partenaire protéique S100A8 ont été décrits comme ayant un effet proviral dans des lymphocytes T CD4+ infectés par le VIH-1 en réactivant la transcription du LTR par la voie NF-B. Cependant, notre équipe a récemment mis en évidence un effet intracellulaire antiviral de S100A9 dans les cellules de Langerhans (LC), un sous type de cellules dendritiques résidant dans la peau et les muqueuses agissant comme une première ligne de défense lors de la primo-infection par le VIH-1. Afin d’étudier le mécanisme antiviral exercé par S100A9, j’ai développé un modèle de délétion de l’expression endogène de S100A9 par la méthode CRISPR-Cas9 dans la lignée myélomonocytique THP-1 (THP-1 S100A9KO) puis généré différentes lignées stables après transduction de lentivecteurs permettant l’expression de protéines S100A9 sauvages (THP-1 S100A9WT) ou mutantes dans leur site de fixation du calcium (THP-1 S100A9ENE/AKA) ou site de phosphorylation (THP-1 S100A9T113A). Les cellules exprimant S100A9 muté au niveau du site de fixation au calcium –mais pas le mutant du site de phosphorylation– perdent leur phénotype de restriction du VIH-1. De plus, le traitement pharmacologique des cellules THP-1 S100A9WT ou de LC dérivées de monocytes sanguins (MoLC) avec des composés ionophores libérant du Ca2+ et Mg2+ dans le cytoplasme inhibent l’effet antiviral de S100A9, confirmant ainsi la dépendance aux cations divalents. Des expériences de PCR quantitatives ont également été menées pour quantifier les produits de transcription inverse dans les cellules infectées, ainsi que des mesures de l’activité enzymatique de la transcriptase inverse du VIH-1 in-vitro, lorsque la disponibilité en cations divalents est modulée. Mes résultats ont en effet montré que S100A9 exerce son activité antivirale dès les étapes précoces de la transcription inverse et suggèrent un mécanisme lié à la chélation de Ca2+ et Mg2+, ce dernier étant connu pour être nécessaire à l’activité enzymatique de la transcriptase inverse. J’ai également réalisé des expériences d’immunoprécipitation montrant que le site de fixation au Ca2+ intact était nécessaire pour la formation d’oligomères semblant être des homodimères de S100A9 et pouvant potentiellement être impliqué dans son activité antivirale. Enfin, j’ai étudié la localisation de S100A9 et sa sécrétion afin d’explorer les mécanismes de régulation de sa fonction dans le cadre de l’infection par le VIH-1, étant donné que S100A9 est capable d’exercer une activité provirale comme antivirale. En générant un mutant au niveau du site de phosphorylation de S100A9, j’ai pu montrer que la phosphorylation de S100A9 n'était requise ni pour son activité antivirale, ni pour sa sécrétion, contrairement à des observations réalisées dans d’autres types cellulaires. J’ai également observé une colocalisation de S100A9 avec une autre alarmine, galectine-3, dans des structures membranaires, suggérant un mécanisme distant de chélation des ions et la possible implication de partenaires protéiques qui reste à explorer. En conclusion, mes travaux montrent que le S100A9 présent dans les cellules myéloïdes est principalement maintenu à l’intérieur des cellules et inhibe l’activité enzymatique de la transcriptase inverse du VIH-1 en chélatant le Ca2+ et le Mg2+.

Alarmins are known as signal mediators that can be released by dying cells or through active release and signal danger to the surrounding cells in order to initiate robust inflammatory and immune responses to cellular damage or pathogen infections. Among them, the divalent cation -binding protein S100A9 and its protein partner S100A8 have been described to exert a proviral effect in HIV-1 infected T cells by reactivating LTR transcription through TLR4-NF-B signaling. However, our team has recently evidenced an intracellular antiviral effect of S100A9 inside human Langerhans cells (LC), a cutaneous- and mucosal-resident subset of dendritic cells acting as a first line of defense during HIV-1 primo-infection1. In order to investigate the specific antiviral mechanism exerted by S100A9, I developed a homemade CRISPR-Cas9 knockout model of S100A9 depletion in the hard-to-transfect myelomonocytic THP-1 cell line (THP-1 S100A9KO), which served as a source to generate cell lines stably expressing wild-type S100A9 (THP-1 S100A9WT), calcium-binding site mutants THP-1 S100A9ENE/AKA), or phosphorylation site mutants (THP-1 S100A9T113A) by lentiviral transduction. Our results showed that THP1 cells expressing S100A9 calcium-binding mutants –but not phosphorylation site mutant– exhibited a loss of HIV-1 restriction. Moreover, treatment of THP-1 cells expressing S100A9 WT or primary blood monocyte-derived Langherans cells (MoLC) with ionophores increasing the intracellular Ca2+ or Mg2+ content also abrogated S100A9-mediated HIV-1 restriction, confirming the divalent cation dependency of the observed antiviral effect. Additionally, I performed quantitative PCR experiments in order to quantify reverse transcription products in infected cells as well as in vitro reverse transcriptase enzymatic activity assay and established that the divalent cation-dependent antiviral activity of S100A9 targeted the early stages of reverse transcription of the viral genome after viral entry into the host cell, a replication step known to require sufficient Mg2+ concentrations. I then performed immunoprecipitation experiments suggesting that the calcium-binding site-dependent formation of higher order S100A9 oligomers, most likely homodimers, may play a role in the antiviral activity of S100A9. Finally, I investigated the cellular localization of S100A9 and its secretion from the cell in order to gain insight into the regulation of S100A9 function in HIV-1 infection, as the protein exhibits opposite intracellular and extracellular effects on HIV-1 infection. By generating a phosphorylation binding site mutant, I was able to show that phosphorylation is not required neither for secretion of S100A9 in Langerhans cells, contrary to other cells types, nor for its antiviral activity. I also observed colocalization of S100A9 with another alarmin, galectin-3, in plasma membrane structures, suggesting a potentially distant ion chelation mechanism and the possible role of protein partners that remain to be investigated. Overall, my work shows that the S100A9 present in myeloid cells is primarily kept inside cells and inhibits the enzymatic activity of HIV-1 reverse transcriptase by chelating Ca2+ and Mg2+.