Analyse structurale et fonctionnelle de la réplication et de la transcription des Bunyavirus

Structural and functional analysis of Bunyavirus replication and transcription

• Auteur / Autrice : Quentin Durieux-Trouilleton
• Direction : Guy Schoehn, Hélène Malet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 18/10/2024
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble, isère, France ; 1992-....)
• Jury : Président / Présidente : Winfried Weissenhorn
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olivier Lambert
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Adeline Goulet, François-Patrice Ferron

Mots clés

Mots clés contrôlés

Orthobunyavirus

ADN -- Réplication

Microscopie électronique

Mots clés libres

Microscopie électronique

Réplication

Bunyavirus

Virus Hantaan

Transcription

ARN Dependent ARN Polymerase

Hantaan virus

Replication

Bunyavirus

Transcription

Electron microscopy

RNA Dependent RNA Polymerase

Résumé

L’ordre des Bunyavirales constitue un ordre vaste et diversifié de plus de 500 virus à ARN à simple brin négatif segmenté, contenant plusieurs virus émergents et/ou hautement pathogènes pour l'homme. Au sein de cet ordre, la famille des Hantaviridae contient le virus Hantaan (HTNV) qui entraîne des fièvres hémorragiques avec syndrome rénal, ainsi que le virus de Sin Nombre (SNV) qui cause des syndromes pulmonaires graves. Ces maladies sont reliées à des taux de mortalité importants, respectivement 15 % et 50 %. Une seconde famille, celle des Peribunyaviridae, contient des virus entraînant des cas d’encéphalites chez les enfants. C’est notamment le cas du virus de La Crosse (LACV). Aucun vaccin ni médicament n'est actuellement approuvé par les autorités de santé pour les contrer.L’objectif de cette thèse est d’étudier ces virus et plus précisément leur ARN polymérase dépendante de l’ARN, qui est une large protéine multi-fonctionnelle de 250kDa. Cette protéine, aussi appelée L, joue un rôle clé dans la réplication et la transcription du génome viral. Les expériences réalisées se sont principalement focalisées sur la polymérase du virus Hantaan (HTNV-L). Des expériences complémentaires ont également été réalisées sur SNV-L et LACV-L.J’ai utilisé la cryo-microscopie électronique (cryo-ME) comme méthode principale pour déterminer la structure d’HTNV-L. Les premières structures partielles d’HTNV-L ont révélé que la structure apo de HTNV-L adopte une conformation inactive avec une configuration α-hélicoïdale inédite du motif catalytique E. L'analyse structurale de la protéine en présence de l'extrémité 5' de l'ARN viral (vRNA) a montré que la liaison de ce dernier entraîne une cascade de modifications impliquant notamment la réorganisation complète du motif catalytique E en une configuration en β-feuillet canonique, ce qui conduit à des changements conformationnels drastiques dans le site actif. La liaison de l'extrémité 5' de l'ARN viral à HTNV-L est également nécessaire pour le recrutement de l'extrémité 3' de l'ARN viral vers le site actif de la polymérase pour l'initiation de la réplication. Les tests d'activité couplés aux structures cryo-ME d’HTNV-L et LACV-L révèlent les mécanismes impliqués dans les différentes étapes de la réplication du génome, notamment son initiation qui utilise un mécanisme d’amorçage et réalignement. Les structures bloquées à l'élongation de la réplication révèlent ensuite la formation d'un double brin d’ARN matrice/produit dans la cavité du site actif, couplée à des changements conformationnels d’HTNV-L.Dans un second temps, le traitement des images par cryo-ME d’HTNV-L apo a également dévoilé les structures haute résolution d’HTNV-L en trois oligomères différents : des monomères, des dimères symétriques et des hexamères symétriques composés de trimères de dimères. La formation de multimères implique des mouvements drastiques des protomères, montrant la capacité de changement conformationnel d’HTNV-L. Ces oligomères ont été l’opportunité d’observer et de résoudre la structure de chacun des domaines d’HTNV-L, y compris les plus flexibles, révélant enfin la structure complète de cette enzyme essentielle.Ensemble, ces éléments révèlent (i) la capacité de multimérisation d’HTNV-L dans sa forme apo inactive, qui correspond probablement à un système de stockage stabilisant et protecteur pour la protéine, (ii) l'activation de la polymérase déclenchée par la liaison de l'ARN viral et (iii) les mécanismes moléculaires complexes sous-jacents à la réplication du génome. Globalement, ces résultats améliorent considérablement la compréhension des mécanismes impliqués dans la réplication du génome des Bunyavirus et fournissent une base solide pour le développement futur d'antiviraux contre ce groupe de pathogènes émergents.

Bunyavirales is a large and diverse order of more than 500 segmented negative-stranded single-stranded RNA viruses, including several emerging and/or highly pathogenic human viruses. Within this order the family Hantaviridae includes the Hantaan virus (HTNV) that causes haemorrhagic fever with renal syndrome, and the Sin Nombre virus (SNV), which can lead to severe pulmonary syndromes. These illnesses are linked to significant mortality rate of 15% and 50% respectively. A second family, Peribunyaviridae, includes viruses that cause encephalitis in children, notably La Crosse virus (LACV). There is currently no vaccine or drug approved by health authorities to combat these viruses.The aim of this thesis is to study these viruses and, in particular, their RNA-dependent RNA polymerase, that is a large multi-functional protein of 250kDa. This protein, also called L protein, plays a key role in the replication and transcription of the viral genome. The experiments that I carried out focused mainly on Hantaan virus polymerase (HTNV-L). Complementary experiments were also performed on SNV-L and LACV-L.I used cryo-electron microscopy (cryo-EM) as the main method to determine the structure of HTNV-L. The first partial structures of HTNV-L revealed that its apo structure adopts an inactive conformation with a novel α-helical configuration of the catalytic motif E. Structural analysis of HTNV-L in the presence of the 5'-end of the viral RNA (vRNA) showed that the binding of the latter triggers a cascade of modifications, that notably involves the complete reorganisation of the catalytic motif E into a canonical β-sheet configuration, leading to drastic conformational changes in the active site. Binding of the viral RNA 5'-end to HTNV-L is also required for the recruitment of the viral RNA 3'-end to the polymerase active site for replication initiation. Activity assays coupled with cryo-EM structures of HTNV-L and LACV-L reveal the mechanisms involved in the different steps of genome replication, in particular its initiation, which uses a prime-and-realign mechanism. Structures stalled during replication elongation then reveal the formation of a template/product duplex in the active site cavity, coupled with conformational changes in HTNV-L.Secondly, cryo-EM imaging of apo HTNV-L also revealed the high-resolution structures of HTNV-L in three different oligomers: monomers, symmetric dimers and symmetric hexamers composed of trimers of dimers. Multimer formation involves large movements of the protomers, demonstrating the ability of HTNV-L to undergo conformational changes. These oligomers provided the opportunity to observe and determine the structure of each domain of HTNV-L, including the most flexible ones, finally revealing the complete structure of this essential viral enzyme.Taken together, these elements reveal (i) the ability of HTNV-L to multimerise in its inactive apo form, which probably corresponds to a stabilising and protective storage system for the protein, (ii) the activation of the polymerase triggered by viral RNA binding, and (iii) the intricate molecular mechanisms underlying genome replication. Collectively, these results significantly improve the understanding of the mechanisms involved in Bunyavirus genome replication and provide a solid basis for the future development of antivirals against this group of emerging pathogens.