Reconnaissance structurale des microARN par les protéines de liaison à l'ARN dans les cancers - Etude de l'interaction entre miR-21 et HuR

Structural recognition of microRNA by RNA-binding proteins in cancers - Study of miR-21 and HuR interaction

• Auteur / Autrice : Virginie Bernard
• Direction : David Pastré, Emilie Steiner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 13/12/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Structure et activité des biomolécules normales et pathologiques (Evry, Essonne ; 2007-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université d'Évry-Val-d'Essonne (1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Ewen Lescop
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Anne-Catherine Prats, Bruno Kieffer, Marina Pinskaya
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne-Catherine Prats, Bruno Kieffer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéine-1 similaire à ELAV

microARN

Cancer

Mots clés libres

Protéine

MiARN

Interaction

Structure

Dynamique

Cancer

Protein

MiRNA

Interaction

Structure

Dynamics

Cancer

Résumé

Comprendre les mécanismes post-transcriptionnels conduisant à l'inflammation chronique et au cancer est crucial pour la prévention et le développement de thérapies. Au cours des dix dernières années, un intérêt particulier s'est porté vers deux classes de molécules régulatrices, représentées par les protéines de liaison à l'ARN (RBP) et les microARN (miARN). Bien que ces régulateurs soient impliqués dans la réponse inflammatoire et la tumorigenèse, des études récentes ont mis en évidence le rôle central d'interactions fonctionnelles entre miARN et RBP lors desquelles ils coopèrent ou s'opposent lors de la régulation d'ARN messager (ARNm) communs. Parmi les RBPs identifiées dans la littérature, la protéine Human Antigen R (HuR/ELAVL1) apparait comme un marqueur protéique prometteur dans la recherche sur le cancer. En effet, exprimée de façon ubiquitaire, elle s'impose comme un acteur important de la régulation de la stabilité et de la traduction d'ARNm codant pour des protéines responsables de la progression tumorale et des métastases. En interagissant avec des séquences riches en Adénine et Uracile (ARE) situées dans la région 3' non traduite (3'-UTR) des ARNm, HuR entre alors en compétition avec des miARN, inhibant leurs fonctions de répression. Plus intéressant encore, HuR est la première RBP reportée ayant la capacité de se lier directement aux miARN matures ajoutant un nouveau niveau de complexité à la régulation de l'expression génique. En effet, il a été montré, qu'en réponse à un stimulus inflammatoire, HuR est transporté du noyau vers le cytoplasme où il se lie directement à miR-21, un miARN oncogène mature, le séquestrant et empêchant ainsi la répression de la traduction de son gène cible PDCD4 (Programmed Cell Death 4), qui contrôle l'apoptose pendant l'inflammation. Ces observations ont conduit à qualifier HuR 'd'éponge' à miARN. Néanmoins, aucun détail mécanistique conduisant à ce mode de régulation combinatoire n'a encore été établi. En utilisant une approche intégrative, l'objectif général a consisté à élucider les signatures structurales menant à la reconnaissance spécifique de miR-21 par HuR. Structuralement, HuR est constituée de trois motifs de reconnaissance à l'ARN (RRM1, 2 et 3) pouvant chacun se lier à des ARE. Dans le cas du recrutement de miR-21 par HuR, les résultats obtenus ont indiqué que la liaison est menée par le tandem RRM1-2. Outre l'élucidation des résidus d'acides aminés responsables de la liaison, les expériences conduites ont montré que HuR dimérise le long de miR-21 en ciblant des séquences nucléotidiques spécifiques, critiques pour l'accroche et pour le maintien du dimère. L'investigation comparative de la protéine HuR pleine longueur et du fragment RRM1-2 a permis de mettre en évidence l'impact du RRM3 sur l'augmentation drastique de la stabilité et de l'affinité du complexe HuR-miR-21. Une étude approfondie a démontré que le RRM3 entraine à travers sa propre homodimérisation une contrainte liant davantage les deux tandems RRM1-2 sur miR-21 et qu'il participe à la multimérisation lorsque les concentrations en ARN le permettent. Les empreintes structurales associées au mécanisme de séquestration de miR-21 par HuR ont été testées par des mutations in vitro et in cellulo, confirmant le rôle spécifique de chacun des RRM lors du recrutement de miR-21 par HuR. Finalement, l'ensemble des résultats obtenus a permis de conduire à la proposition d'un modèle d'interaction HuR-miR-21 ouvrant la voie à la recherche de molécules à visée thérapeutique ciblant la réponse cellulaire à l'inflammation. D'autres miARN partenaires de HuR ont déjà été identifiés indiquant que les données spécifiques à la séquestration de miR-21 par HuR pourront servir de base à la compréhension de l'interactome HuR-miARN.

Understanding post-transcriptional mechanisms leading to chronic inflammation and cancer is crucial for prevention and therapies to be developed. Over the last decade, interest has grown towards two classes of regulatory molecules represented by RNA-binding proteins (RBP) and microRNA (miRNA). While these regulators have shown to be involved in inflammatory response and tumorigenesis, recent studies have highlighted a functional interplay among themselves, where miRNA and RBP either cooperate or counteract in the regulation of shared messenger RNA (mRNA). Among reported RBP, the protein Human Antigen R (HuR/ELAVL1) appears as a promising protein biomarker in cancer research. In fact, ubiquitously expressed, this protein appears as a key regulator in the stability and the translation of mRNA coding for proteins implicated in tumor progression and metastases. When binding to Adenine and Uracil rich sequences (ARE) located in the 3' Untranslated Region (UTR) of mRNA, HuR competes with miRNA, inhibiting their repressive function. More interestingly, HuR is the first reported RBP with the ability to directly bind to mature miRNA adding a new layer of complexity in the regulation of gene expression. Indeed, it has been shown that, in response to inflammatory stimulus, HuR undergoes nuclear-cytoplasmic shuttling where it binds to miR-21, a mature oncogenic miRNA, sequestering it and thus preventing the translation repression of PDCD4, a gene which controls apoptosis during inflammation. These observations have led to the proposition of HuR acting as a 'miRNA sponge'. Nevertheless, no mechanistic details leading to this mode of combinatorial regulation have been established yet.By using an integrative approach, the general objective was to elucidate the structural signatures leading to specific recognition of miR-21 by HuR. Structurally, HuR consists of three RNA Recognition Motifs (RRM1, 2 and 3), each of them binding to ARE. In the case of miR-21 recruitment by HuR, the results obtained indicated that the tandem RRM1-2 drives the binding. Besides the elucidation of the amino acid residues responsible for the binding, experiments showed that HuR dimerizes along miR-21, targeting specific nucleotide sequences, critical for the dimer establishment and holding onto miR-21. The comparative investigation of HuR full-length and RRM1-2 fragment highlighted the impact of RRM3 on the drastic increase in the stability and the affinity of HuR-miR-21 complex. An in-depth study has shown that RRM3 leads, through its own homodimerization, to a more constrained fixation of the two RRM1-2 tandems on miR-21 and that it can be part of multimerization processes depending on the local RNA concentrations. Structural fingerprints linked to the sequestration mechanism of miR-21 by HuR were tested by in vitro and in cellulo mutations, confirming the specific role of each RRM during the recruitment of miR-21 by HuR.Finally, the results obtained led to the proposal of a HuR-miR-21 interaction model which could open the way to the search for therapeutic molecules targeting the cellular response to inflammation. Other miRNA partners of HuR have already been identified, indicating that data specific to miR-21 sequestration by HuR could provide a basis for understanding HuR-miRNA interactome.