Dynamique d'assemblage de peptides bêta-amyloïdes par nanopore unique

par Nathan Meyer

Projet de thèse en Chimie et Physico-Chimie des Matériaux

Sous la direction de Sébastien Balme et de Joan Torrent.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques , en partenariat avec IEM - Institut Européen des Membranes (laboratoire) et de DM3 - Design des Matériaux Membranaires et systèmes Multifonctionnels (equipe de recherche) depuis le 01-09-2020 .


  • Résumé

    Contexte L'analyse en temps réel et à bas coût des marqueurs biologiques présents en faible concentration dans un échantillon revêt une importance stratégique pour la mise en place d'outils de diagnostic précoce de maladie d'Alzheimer avant l'apparition des premiers symptômes. Parmi ces biomarqueurs, nous nous intéressons aux peptides bêta-amyloïdes qui sont les composants majoritaires des plaques amyloïdes, que l'on retrouve dans les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. L'hypothèse de la 'cascade amyloïde' propose que l'accumulation de ce peptide amyloïde induit une toxicité pour les cellules nerveuses. Les amyloïdes sont des assemblages ordonnés de protéines ou peptides dont le mécanisme de formation n'est pas totalement élucidé. En effet, il n'existe aucune méthodologie permettant de caractériser en continu l'évolution structurale (par exemple une modification de taille et de morphologie) d'une protéine ou d'un peptide, au cours de ses transformations pathologiques. Pour lever ce verrou, la technologie « nanopore unique » serait une solution efficace face aux méthodes conventionnelles. Cette technologie permet de détecter et caractériser en temps réel des macromolécules traversant un pore de diamètre ajustable, avec des dimensions comparables à l'analyte d'intérêt, via un détecteur basé sur des mesures de résistance. La détection électrique à base de nanopores (c.-à-d. les perturbations du courant induit par le passage d'un objet) est basée sur le principe de la molécule unique et permet d'obtenir une « empreinte digitale » de la macromolécule en fonction de sa taille, de sa charge, de son moment dipolaire et de son interaction avec le nanopore. De ce fait, chaque macromolécule a en « théorie » une signature unique. La technologie « nanopore » pour détecter des particules protéiques uniques et caractériser leur morphologie résout des problèmes et des limites associés à d'autres technologies, comme l'absence totale de tout marquage et des concentrations très faibles (pM) pour l'échantillon. Notre approche expérimentale « nanopore unique » a déjà été validée au laboratoire pour élucider des intermédiaires amyloïdogéniques de la beta-lactoglobuline et de la protéine tau. Le projet de thèse concerne le développement de cette approche sur les peptides bêta-amyloïdes. Il s'agit d'un moyen original et novateur pour mettre en évidence les modifications structurales et leurs dynamiques durant le processus d'agrégation amyloïde. L'application de cette technologie nous permettra par exemple de caractériser l'impact des polluants environnementaux sur le taux d'agrégation et la morphologie amyloïde. Objectifs du projet Le principal objectif est de développer une nouvelle méthodologie, à l'échelle de la molécule unique, permettant d'étudier la dynamique d'assemblage de peptides bêta-amyloïdes in vitro. Cette méthodologie nous permettra d'apporter un nouvel éclairage sur le mécanisme de leur formation et nous permettra d'envisager de nouvelles stratégies diagnostiques ou thérapeutiques pour les moduler afin de limiter les troubles cognitifs et la démence. Méthodologie Le projet s'appuiera sur une approche pluridisciplinaire à l'interface entre la biologie, la chimie et la physique. Dans un premier temps, le projet de thèse consistera à produire des assemblages de peptides bêta-amyloïdes de taille différente et les caractériser par des techniques d'imagerie (microscopie électronique en transmission) et des techniques spectroscopiques (diffusion dynamique de la lumière). Ensuite, ces assemblages seront analysés par la technologie « nanopore unique » afin de corréler les perturbations électriques ainsi obtenues (amplitude, temps, fréquence) avec les données structurales. L'objectif de cette première partie de thèse sera de corréler les signaux obtenus par la méthode pulse de résistance à la morphologie et la taille des agrégats. Nous envisageons le recours à des modèles statistiques (PCA) pour nous aider à pour obtenir une gamme étalon. La seconde partie du travail de thèse sera d'utiliser la gamme étalon précédente pour déterminer au mieux la composition d'un mélange d'agrégats et ainsi de retracer les cinétiques des différents intermédiaires. Enfin, une fois la méthodologie éprouvée, nous l'appliquerons pour comprendre l'influence des pesticides sur la dynamique d'agrégation des amyloïdes bêta.

  • Titre traduit

    dynamic of beta-amyloide peptide assembly using single nanopore


  • Résumé

    Real-time, low-cost analysis of biological markers present in low concentrations in a sample is of strategic importance for the development of tools for the early diagnosis of Alzheimer's disease before the onset of the first symptoms. Among these biomarkers, we are interested in beta-amyloid peptides, which are the major components of amyloid plaques, found in Alzheimer's disease patients. The 'amyloid cascade hypothesis' proposes that the accumulation of this amyloid peptide induces toxicity to nerve cells. Amyloids are ordered assemblages of proteins or peptides whose mechanism of formation is not fully elucidated. Indeed, there is no methodology for continuously characterizing the structural evolution (e.g. a change in size and morphology) of a protein or peptide during its pathological transformations. In order to overcome this barrier, "single nanopore" technology would be an effective solution to conventional methods. This technology allows real-time detection and characterization of macromolecules passing through a pore of adjustable diameter, with dimensions comparable to the analyte of interest, via a detector based on resistance measurements. Nanopore-based electrical sensing (i.e., current disturbances induced by the passage of an object) is based on the single molecule principle and allows a "fingerprint" of the macromolecule to be obtained as a function of its size, charge, dipole moment and interaction with the nanopore. As a result, each macromolecule "theoretically" has a unique signature. Nanopore" technology for detecting unique protein particles and characterizing their morphology solves problems and limitations associated with other technologies, such as the total absence of any labeling and very low concentrations (pM) for the sample. Our "single nanopore" experimental approach has already been validated in the laboratory to elucidate amyloidogenic intermediates of beta-lactoglobulin and tau protein. The thesis project concerns the development of this approach on beta-amyloid peptides. It is an original and innovative way to highlight the structural modifications and their dynamics during the amyloid aggregation process. The application of this technology will allow us, for example, to characterize the impact of environmental pollutants on the rate of aggregation and amyloid morphology. Objectives of the project The main objective is to develop a new methodology, at the scale of the single molecule, to study the assembly dynamics of beta-amyloid peptides in vitro. This methodology will allow us to shed new light on the mechanism of their formation and will allow us to envisage new diagnostic or therapeutic strategies to modulate them in order to limit cognitive disorders and dementia. Methodology The project will be based on a multidisciplinary approach at the interface between biology, chemistry and physics. Initially, the thesis project will consist of producing beta-amyloid peptide assemblies of different sizes and characterizing them using imaging techniques (transmission electron microscopy) and spectroscopic techniques (dynamic light scattering). Then, these assemblies will be analyzed using "single nanopore" technology in order to correlate the resulting electrical perturbations (amplitude, time, frequency) with structural data. The objective of this first part of the thesis will be to correlate the signals obtained by the pulse resistance method with the morphology and size of the aggregates. We envisage the use of statistical models (PCA) to help us to obtain a standard range. The second part of the thesis work will be to use the previous standard range to better determine the composition of a mixture of aggregates and thus to trace the kinetics of the different intermediates. Finally, once the methodology has been tested, we will apply it to understand the influence of pesticides on the aggregation dynamics of beta amyloids.