Coordination des fonctions de PLK1:BRCA2:PP2A dans l'integrité des chromosomes au cours du cycle cellulaire

Coordination of the chromosome integrity functions of PLK1:BRCA2:PP2A throughout the cell cycle

• Auteur / Autrice : Rady Chaaban
• Direction : Aura Carreira
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences du Cancer
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 10/12/2024
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Integrite du genome, ARN et cancer
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie - PSL
• Jury : Président / Présidente : Fumiko Esashi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Aura Carreira, Florence Larminat, Daniele Fachinetti, Carlos Perea
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Fumiko Esashi, Florence Larminat

Mots clés

Mots clés libres

Cancer du sein

Integrité de chromosomes

Brca2

Cycle cellulaire

Plk1

Pp2a

Breast cancer

Chromosome integrity

Brca2

Cell cycle

Plk1

Pp2a

Résumé

Le suppresseur de tumeur BRCA2 est crucial pendant les phases S/G2 du cycle cellulaire, où il favorise la réparation de l'ADN par recombinaison homologue et stabilise les fourches de réplication. Ces fonctions garantissent l'intégrité du génome. L'intégrité chromosomique implique un alignement et une séparation corrects des chromosomes en mitose. Des défauts dans ce processus entraînent l'aneuploïdie, une caractéristique du cancer. Des travaux récents de notre équipe ont montré que la phosphorylation de BRCA2 à son extrémité N-terminale par PLK1 favorise l'alignement des chromosomes. Dans ce contexte, BRCA2 forme un complexe avec des acteurs clés pour la stabilité des liaisons microtubules-kinétochores (KT), comme PLK1, BUBR1 et PP2A. La perturbation de ce complexe entraîne un alignement/ségrégation défectueux des chromosomes. Pour mieux comprendre la régulation de ces acteurs au KT, nous avons étudié une région spécifique de BRCA21093-1158, contenant des phosphosites putatifs de PLK1 et interagissant avec la phosphatase PP2A. Avec des méthodes biophysiques, nous avons identifié S1115 et S1121 comme phosphosites clés de PLK1. Leur biphosphorylation favorise l'interaction BRCA2:PP2A in vitro. De plus, une spectrométrie de masse (MS) de BRCA21093-1158 incubée avec des extraits mitotiques a identifié PLK1 enrichi dans la forme phosphorylée de BRCA21093-1158. Nous avons sélectionné les variants S1115C et S1121L pour étudier l'impact de la modification de ces phosphosites en mitose. Dans les cellules stables exprimant les variants BRCA2-S1115C et -S1121L, le complexe BRCA2 avec PLK1 et PP2A était réduit, confirmant nos résultats MS et in vitro. Les étalements en métaphase ont montré une localisation réduite de PLK1 et PP2A au KT, un phénotype observé dans les cellules déficientes en BRCA2. Cela suggère que BRCA2 est crucial pour la localisation de PLK1 et PP2A au KT. Les cellules exprimant BRCA2-S1115C ou -S1121L présentaient aussi des niveaux réduits de pBUBR1 et pBRCA2 au KT et une augmentation des misalignements chromosomiques. Les niveaux d'Aurora B-pT232 et de RPA32-pS33 étaient réduits dans les cellules mitotiques S1115C et S1121L, tandis qu'elles présentaient une accumulation de R-loops au KT. La présence de R-loops au centromère en mitose déclenche une signalisation ATR via RPA32-pS33, activant Aurora B. Nos résultats suggèrent donc une voie ATR mitotique compromise. Pour tester si cette altération était spécifique à la mitose, nous avons induit un stress réplicatif dans les deux lignées. La phosphorylation de CHK1 et de RPA était réduite par rapport aux cellules WT, indiquant un checkpoint G2/M compromis. Nous avons aussi observé un complexe BRCA2:PP2A réduit. Cela nous a amenés à tester une interaction de BRCA2 avec RPA. Le groupe de Sophie Zinn-Justin a confirmé une interaction entre la sous-unité RPA70 et la forme non phosphorylée de BRCA21093-1158 in vitro, impliquant les résidus S1115 et S1121 que nous avons confirmé dans nos cellules. Nous proposons que le complexe BRCA2 avec PP2A pourrait réguler la déphosphorylation de RPA32 en conditions de stress réplicatif et en mitose. Cependant, il reste à comprendre si l'interaction observée avec RPA70 affecte ce complexe. En conclusion, ce travail suggère que BRCA2 agit comme un support pour le recrutement/la rétention de PLK1, PP2A et d'autres protéines au KT pour un alignement correct des chromosomes. En mitose et lors de stress réplicatif, l'interaction de BRCA2 avec PP2A et RPA pourrait être nécessaire pour contrôler la phosphorylation/déphosphorylation de RPA, un mécanisme essentiel pour le maintien des checkpoints du cycle cellulaire. Nos résultats soulignent la coordination des fonctions de BRCA2 et PP2A et d'autres acteurs pour maintenir l'intégrité chromosomique au cours du cycle cellulaire, et suggère comment les variants de BRCA2 dans cette région pourraient influencer la fonction cellulaire et le risque de cancer, au-delà de la recombinaison homologue.

The tumor suppressor BRCA2 is crucial in the S/G2 phases of the cell cycle, promoting DNA damage repair through homologous recombination and replication fork stability. These functions ensure genome integrity. Chromosome integrity entails the proper alignment and segregation of chromosomes during mitosis. Defects in this process lead to aneuploidy, a hallmark of cancer. Recent work from our team revealed that phosphorylation of BRCA2 at its N-terminus by PLK1 favors chromosome alignment. In this context, BRCA2 is in complex with key players ensuring stable kinetochore-microtubule attachments such as PLK1, BUBR1, and PP2A. Disruption of this complex results in faulty chromosome alignment/segregation. To better understand the regulation of these players at the kinetochore (KT), we investigated a specific region of BRCA21093-1158, which contains putative PLK1 phosphosites and interacts with the phosphatase PP2A. Using biophysical methods, we identified S1115 and S1121 as key PLK1-phosphosites. Their biphosphorylation favors BRCA2:PP2A interaction in vitro. Additionally, a mass-spectrometry (MS) screen using an avi-tagged version of BRCA21093-1158 incubated with mitotic cell extracts identified PLK1 as enriched in the phosphorylated BRCA21093-1158. We selected breast cancer variants S1115C and S1121L to study the impact of altering these PLK1-mediated phosphorylation sites in mitosis. In stable cells expressing BRCA2-S1115C and -S1121L, BRCA2 complex with PLK1 and PP2A was reduced corroborating our MS and in vitro findings. Metaphase spreads in both cell lines showed reduced localization of PLK1 and PP2A at the KT, a phenotype also observed in BRCA2-deficient cells. This suggested that BRCA2 is important for the localization/retention of PLK1 and PP2A at the KT. Cells expressing BRCA2-S1115C or -S1121L also displayed reduced levels of pBUBR1 and pBRCA2 at the KT and increased chromosome misalignment. The levels of Aurora B-pT232 and RPA32-pS33 were reduced in S1115C and S1121L mitotic cells while they showed accumulation of R-loops at the KT. The presence of R-loops at the centromeric region in mitosis have been shown to trigger an ATR signaling mediated by RPA32-pS33 resulting in the activation of Aurora B. Thus, our results suggest a compromised mitotic ATR pathway. To address whether this impairment was specific to mitosis, we induced replication stress with hydroxyurea (HU) in both cell lines. The phosphorylation of CHK1 and RPA were reduced compared to WT cells indicating a compromised G2/M checkpoint. We also observed a reduced BRCA2:PP2A complex. This prompted us to test a possible interaction of BRCA2 with RPA. Interestingly, the group of Sophie Zinn-Justin confirmed the direct interaction between the RPA70 subunit and the non-phosphorylated BRCA21093-1158 in vitro using recombinant peptides and found that this interaction involved S1115 and S1121 residues. We confirmed this complex in HU-treated cells. We propose that BRCA2 complex with PP2A might be regulating RPA32 dephosphorylation both in replication stress conditions and in mitosis. However, whether the interaction observed with RPA70 affects this complex remains to be elucidated. In conclusion, our work suggests that BRCA2 serves as scaffold for the recruitment/retention of PLK1, PP2A and other proteins to the KT to promote correct alignment of chromosomes. In both mitosis and upon replication stress, BRCA2 interaction with PP2A and RPA might be required to control RPA phosphorylation/dephosphorylation, a molecular switch that is essential for cell cycle checkpoint maintenance. Our findings shed light on the coordination of replication and mitotic functions of BRCA2 and PP2A and that of other players to maintain chromosome integrity throughout the cell cycle. It also highlights other possible means by which breast cancer variants of BRCA2, specifically in this region, could be affecting cell function and thus cancer risk, beyond homologous recombination.