Utilisation des intracorps pour le développement de thérapeutiques ciblant les agrégats protéiques dans la SLA

The use of intrabodies for the development of therapeutics targeting protein Aggregates in ALS

• Auteur / Autrice : Rudolf Hergesheimer
• Direction : Hélène Blasco
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie
• Date : Soutenance le 13/12/2021
• Etablissement(s) : Tours
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Imagerie et cerveau
• Jury : Président / Présidente : Pierre Martineau
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Lucie Pellissier, Stéphanie Duguez, Edor Kabashi, Marie-Claude Viaud-Massuard
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Pierre-François Pradat, Jean-Pierre Julien

Mots clés

Mots clés contrôlés

Étiologie

Thérapie moléculaire ciblée

Métabolomique

Prévention

Protéines -- Agrégation

Criblage pharmacologique

Lutte contre

Protéine TDP-43

Médicaments protéiques

Physiopathologie

Sclérose latérale amyotrophique

Microagrégats

Médicaments -- Récepteurs

Mots clés libres

Sclérose Latérale Amyotrophique

Tdp-43

Agrégation

Thérapeutique

Intracorps

Amyotrophic Lateral Sclerosis

Tdp-43

Aggregation

Therapeutics

Intrabodies

Résumé

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative dévastatrice caracté-risée par la perte des motoneurones. A ce jour, cette maladie demeure assez méconnue sans traite-ment efficace en clinique. Ainsi, la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques constitue un axe principal dans l'étude de la SLA. Récemment, la présence d'agrégats protéiques contenant la pro-téine TDP-43 dans le cytoplasme des motoneurones est devenue caractéristique principale de la SLA. Ainsi, mon travail de Thèse s'est organisé en 2 axes : la caractérisation de TDP-43 dans la SLA et son rôle pathologique, puis la prévention de son agrégation via les intracorps.Premièrement, nous avons fait l'état de l'art sur le rôle toxique des agrégats TDP-43 dans la SLA (Publication 1: Hergesheimer et al., 2019). Puis nous avons caractérisé la toxicité des agrégats protéiques (Publication 2 : Lanznaster et al., 2019) et étudié sa propagation en culture cellulaire uti-lisant le modèle de HEK293T surexprimant TDP-43 sauvage. Conformément à d'autres études, nous avons retrouvé la protéine dans le milieu de culture de cellules surexprimant TDP-43. Ainsi, nous avons suspecté que cette forme de TDP-43 extracellulaire pouvait perturber des cellules naïves. En effet, ce milieu conditionné a modifié la morphologie, la prolifération et le métabolisme cellulaire (Publication 3 : Hergesheimer et al., 2020). Ces modifications confirment des observations réalisées notamment dans d'autres études cliniques. Curieusement, nous n'avons pas détecté la présence de TDP-43 dans les cellules naïves, ce qui suggère que la propagation cellulaire n'était pas nécessaire pour l'induction d'une toxicité associée à TDP-43.Deuxièmement, nous nous sommes intéressés au développement de thérapeutiques ciblant TDP-43. Nous avons ensuite mis en place un système de criblage de fragments d'anticorps sous forme de scFv via le phage display dans le but d'identifier des intracorps liant TDP-43. Nous en avons identifié 4 suggérant une affinité spécifique. La prédiction in silico de sites de liaison a sug-géré de multiples régions cibles possibles de TDP-43, notamment la N-terminale, les domaines de liaison à l'ARN et la C-terminale. Nous avons constaté que 2 sur les 4 intracorps se sont fortement exprimés sans induire de cytotoxicité chez notre modèle cellulaire. Nous avons remarqué un rôle protecteur possible d'un intracorps en particulier qui a diminué l'agrégation du fragment C-terminal de TDP-43 faisant 35 kDa. En effet, ce fragment est retrouvé dans les agrégats observés chez les patients atteint de la SLA.Dans ce travail, nous avons déterminé des critères fiables et reproductibles liés à la toxicité de TDP-43 afin d'évaluer leurs modifications sous l'effet d'une thérapeutique. Ensuite, nous avons testé une nouvelle stratégie thérapeutique qui semble tout à fait prometteuse, basée sur le criblage d'intracorps. Alors que les effets protecteurs des principaux candidats sont en cours d'évaluation dans différents modèles cellulaires, nous avons envisagé la possibilité d'utiliser ces intracorps pour d'autres applications qu'une thérapeutique directe : les utiliser comme outil de développement de molécules chimiques compétitives et surtout comme outil de suivi de la progression de la maladie en imagerie. Ainsi, cet éclairage sur TDP-43 et sur l'intérêt de développer des intracorps dans un but thérapeutique ou de suivi permet de proposer ce type de stratégie à d'autres protéinopathies ou à d'autres pathologies associées aux agrégats TDP-43.

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease characterized by the pro-gressive loss of motor neurons. To this day, the disease remains poorly understood and without an effective clinical treatment. Hence, the search for novel therapeutic strategies constitutes a major field of research for this disease. Recently, the aggregation of the protein TDP-43 in the cytoplasm of degenerated motor neurons has become the hallmark of ALS. Therefore, my thesis project fo-cused on 2 objectives: the characterization of the pathology of TDP-43 and the prevention of its aggregation via the binding of intrabodies.First, we assessed the toxic role of TDP-43 aggregates in ALS by conducting an extensive review of the literature (Publication 1: Hergesheimer et al., 2019). We then evaluated the toxic behavior of overexpressed TDP-43 in our HEK293T cellular model (Publication 2 : Lanznaster et al., 2019), as well as studied its documented cellular propagation. Indeed, we found the overexpressed TDP-43 in the culture medium. Thus, we suspected that this extracellular TDP-43 could disrupt naïve cells. Cells cultured in the conditioned medium showed altered morphology, proliferation, and metabo-lism (Publication 3 : Hergesheimer et al., 2020). These results are in agreement with other clinical studies. Surprisingly, however, we did not detect TDP-43 in naïve cells, which suggested that the physical propagation of TDP-43 was not necessary to induce toxic effects associated with TDP-43.Next, we turned our attention to developing a therapeutic strategy of targeting TDP-43. Through phage display, we screened scFv antibody fragments against purified TDP-43 and identified 4 can-didates. The in silico binding site prediction suggested that the scFv's could potentially bind several domains of TDP-43, including the N-terminus, the RNA-binding domains, and the C-terminus. We found that 2 of the 4 scFv's were able to be expressed in our cell model without inducing cytotoxi-city. We also observed a potential protective effect for one intrabody, which inhibited the aggrega-tion of the 35 kDa C-terminal fragment of TDP-43. Indeed, this fragment is associated with patho-logical TDP-43 aggregation in ALS patients.In this work, we identified reliable and reproducible criteria linked to TDP-43 pathology that could be used to evaluate therapeutic approaches to targeting TDP-43, which in our case utilized intra-bodies. While the protective effects of our candidates are in the process of evaluation in various cellular models, we propose that these intrabodies could be employed for purposes other than ther-apeutic; they could be used to identify small molecules competing for the same binding site and could be utilized to track disease progression as a TDP-43 marker. In this sense, the wide range of possible applications of these intrabodies open up the potential to target other pathologies related to TDP-43 proteinopathy.