La méthylation de l’ADN chez Plasmodium falciparum : une nouvelle cible épigénétique pour la découverte de nouveaux antipaludiques

DNA methylation in P. falciparum : a novel epigenetic target for new antimalarial discoveries

• Auteur / Autrice : Elie Hammam
• Direction : Artur Scherf
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Parasitologie moléculaire
• Date : Soutenance le 17/10/2019
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Biologie des interactions hôte-parasite
• Jury : Président / Présidente : Olivier Silvie
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Paola Barbara Arimondo, Vembar Shruthi, Peter Preiser
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Claire Francastel, Lucy Glover

Mots clés

Mots clés contrôlés

Méthylation

ADN

Plasmodium falciparum

Mots clés libres

Plasmodium falciparum

Méthylation

ADN

5-Methylcytosine

5-Hydroxymethylcytosine

ADN methyltransférases

Plasmodium falciparum

Methylation

DNA

Résumé

La méthylation de la cytosine de l’ADN (5mC) est une marque épigénétique très bien établie chez les eucaryotes supérieurs contrôlant l'expression des gènes et jouant un rôle clé dans un large éventail de processus biologiques tels que l'empreinte génomique et l'inactivation du chromosme X. L’hydroxyméthylation de l’ADN (5hmC) a récemment attiré beaucoup d’attention dans le domaine de l’épigénétique et a été validée en tant que marque distincte de 5mC, ayant différentes fonctions et impact sur l’expression des gènes. Chez le parasite humain du paludisme P. falciparum, la présence de méthylation de l’ADN est depuis longtemps sujet à controverse dans la littérature jusqu’à ce qu’on ait récemment démontré que l’ADN 5mC est présent à des niveaux relativement élevés dans le génome du parasite. Au cours de cette thèse, nous avons utilisé des technologies de pointe, notamment l'immunoprécipitation de l'ADN hydroxymétylée couplée au séquençage et le « oxidative-bisulfite/biuslfite-sequencing » (oxBS / BS-seq) pour étudier la présence d'hydroxyméthylation de l'ADN dans le parasite. Nous avons montré pour la première fois que la modification de l’ADN la plus abondante chez P. falciparum n’est pas 5mC mais plutôt une modification de type 5hmC, présente principalement dans le corps des gènes activement transcrits, alors que 5mC est présente à des niveaux très bas. D'autre part, nous avons utilisé l'édition du génome CRISPR-Cas9 pour générer des parasites mutants dépourvus de Pf.DNMT2 et avons montré que l'enzyme n'était pas nécessaire pour l'activité de la DNMT dans les extraits nucléaires de parasites. Cela indique que le parasite code pour d'autres DNMT non identifiés bioinformatiquement. Fait intéressant, le taux d'engagement sexuel des parasites dépourvus de DNMT2 a été multiplié par 8 par rapport aux parasites 3D7 de type sauvage. Nos données indiquent que Pf.DNMT2 est lié au contrôle de l'engagement sexuel chez Plasmodium. Enfin, nous avons criblé des inhibiteurs de l’ADN méthylatransférase humaine dérivés de la famille des quinazolines-quinoléines et avons montré que ces inihibiteurs sont très efficaces et tuent les parasites en moins de 6 heures. De plus, nous avons utilisé des tests d'activité in vitro de DNMT et avons montré que les hDNMTi réduisaient de manière significative l'activité DNMT dans les extraits nucléaires de P. falciparum. Fait intéressant, les inhibiteurs de DNMT sélectionnés étaient également actifs contre les isolats cliniques résistants à l'artémisinine. Dans l’ensemble, nos données valident fortement la voie de la méthylation de l’ADN chez P. falciparum en tant que nouvelle cible thérapeutique potentielle pour de nouvelles découvertes antipaludiques.

DNA cytosine methylation (5mC) is a very well established epigenetic mark in higher eukaryotes controlling gene expression and playing a key role in a wide range of biological processes such as genomic imprinting and X chromosme inactivation. Recently, DNA hydroxymethylation (5hmC) has gained a lot of attention in the epigenetics field and has been validated as a separate mark from 5mC having different functions and impact on gene expression. In the human protozoan malaria parasite Plasmodium falciparum, the presence of DNA 5mC has long been a subject of controversy in the litterature. During the course of this Ph.D we revisited this topic using state-of-the-art technologies including hydroxymetylated DNA immunoprecipitation coupled to sequencing and oxidative bisulfite/bisulfite sequencing (oxBS/BS-seq) to investigate the presence of DNA cytosine methylation in this human pathogen. We showed for the first time that the most abundant DNA modification in P. falciparum is not 5mC but a novel type of cytosine modification we call here 5hmC-like modification. This modification is enriched in the gene body of actively transcribed genes. In P. falciparum, only one of the three canonical DNA methyltransferase type of genes have been detected. We used CRISPR-Cas9 genome editing to generate mutant parasites lacking the predicted cytosine DNA methyltransferase gene Pf.DNMT2. We show that the enzyme is not essential for parasite proliferation and is not required for DNMT activity in parasite nuclear extracts. This points to the existence of noncanonical DNMTs gene(s) in this pathogen. Importantly, parasites lacking DNMT2 showed an 8-10 fold increase in their sexual commitment rate when compared to wild-type 3D7 parasites. Linking Pf.DNMT2 to the control of malaria sexual commitment is an unprecedented finding. Although DNMT2 has been shown to methylate tRNA in other organism and in P. falciparum, it remains unclear how this function contributes to the activation of gametocyte development. Finally, we show that a new generation of human DNA methyltransferase inhibitors is highly efficient in killing multidrug resistant parasite and significantly reduces DNMT activity in P. falciparum nuclear extracts. Taken together, our data validate the existence of atypical DNA methylation pathways in P. falciparum that can be targeted for the development of novel antimalarial drugs.